Q2. Como é que o Sequenciamento de RNA Direto por Nanopore difere do RNA-seq tradicional?

O RNA-seq tradicional converte RNA em cDNA e amplifica-o por PCR, o que pode introduzir viés e remover marcas químicas nativas. O RNA Direto por Nanopore lê moléculas de RNA nativas diretamente numa orientação 3′→5′ sem RT/PCR, preservando modificações de RNA e permitindo medições da cauda poli(A) por leitura, juntamente com isoformas de comprimento total.

Q3. Quais são os principais desafios do RNA Direto?

O RNA Direto atualmente tem um rendimento mais baixo do que o cDNA e uma taxa de erro por leitura única mais alta do que o Illumina, e requer uma análise especializada e consciente do sinal, além de computação adequada. Na prática, mitigamos essas limitações com um design experimental apropriado, consenso entre leituras, alinhamento robusto e controlo de qualidade cuidadoso.

Q4. O RNA Direto pode fazer análise de expressão génica, isoforma de splicing e transcritos de fusão?

Sim, desde que o estudo seja projetado para esses objetivos. Rotineiramente quantificamos transcritos, analisamos o uso de isoformas (AltTP/DIU) e detectamos transcritos de fusão com evidência de moléculas únicas; no entanto, para coortes muito grandes focadas exclusivamente em DE a nível de genes, cDNA/Illumina pode ser mais económico, enquanto o RNA Direto é preferido para estudos orientados por mecanismos onde as características do RNA nativo são críticas.

Q5. É possível perfilar caudas poli(A) e modificações de RNA na mesma execução?

Sim. Tanto o comprimento da cauda poli(A) quanto as assinaturas de modificação, como m6A, m5C e Ψ/inosina, são derivadas do mesmo sinal de nanopore no RNA nativo, permitindo uma interpretação conjunta nas próprias moléculas que carregam as características.

Q6. O RNA Direto é específico de fita, e quanto à truncagem 5′?

As leituras são inerentemente específicas de fita e procedem de 3′→5′ a partir de um adaptador poli(T). Algumas leituras são truncadas a 5′ por química e dinâmicas do poro; nossos passos de agrupamento de isoformas e desredundância levam isso em conta para que as chamadas a nível de isoforma permaneçam fiáveis.

Q8. As leituras de RNA Direto por Nanopore detectam m6A diretamente?

Sim. Como o RNA nativo passa pelo poro sem RT/PCR, o m6A produz assinaturas de corrente características que podem ser chamadas com resolução próxima ao nível de base e ligadas a transcritos e isoformas específicas.

Q10. Como é que o RNA Direto difere do RNA-seq de leitura longa de cDNA ou de leitura curta de Illumina?

As leituras de RNA Direto leem RNA nativo (3′→5′) sem RT/PCR, preservando modificações de RNA e permitindo poli(A) por leitura. O cDNA/leitura curta perde modificações nativas e infere isoformas a partir de fragmentos.

Serviço de Sequenciação de RNA Direto por Nanoporos

Índice

Visão Geral: O Que É Sequenciação de RNA Direto por Nanoporos?

A Sequenciação de RNA Direto por Nanoporos é a única abordagem que lê moléculas de RNA nativas diretamente—sem transcrição reversa ou PCR—portanto, os seus dados preservam modificações de base do mundo real e características por molécula. A sequenciação avança de 3′→5′ a partir de um adaptador poli(T), produzindo leituras longas de moléculas únicas que abrangem estruturas completas de 5′-UTR–CDS–3′-UTR.

Como funciona

O RNA Poly(A)+ (ou uma captura personalizada) é preparado e ligado a um adaptador poli(T) com uma proteína motora.
Translocar através do poro: Cada cadeia de RNA é puxada através de um nanoporo onde as alterações na corrente iónica codificam as identidades dos nucleótidos.
Decodificação e análise: A chamada de base reconstrói a sequência enquanto algoritmos sensíveis ao sinal produzem assinaturas de modificação de RNA (m6A/m5C/Ψ/I) e o comprimento da cauda poli(A) por leitura.
A orientação e a química estão documentadas no nosso protocolo validado de sequenciação direta de RNA por Nanopore, como parte do fluxo de trabalho de sequenciação direta de RNA por Nanopore.

Por que é importante

Isoformas de comprimento total, sem montagem: Leituras longas resolvem diretamente o splicing alternativo e estruturas de transcritos complexas, reduzindo erros de inferência comuns em leituras curtas. RNA-seq.
Epitranscriptoma nativo: Como não há RT/PCR, as verdadeiras modificações químicas do RNA são retidas e detectáveis a uma resolução quase a nível de base.
Biologia do Poly(A): O comprimento da cauda poly(A) por leitura permite estudos de estabilidade, tradução e regulação específica de isoformas.
Menor amplificação/bias de GC: bibliotecas sem PCR melhoram a quantificação de RNAs com extremos de GC e estruturados.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de RNA Direto com Nanoporos

An infographic illustrating the four stages of Nanopore Direct RNA Sequencing: Sample Prep, Library Prep and Run, Data Processing, and Analytics and Hand-off.

1. Recibo de amostra e QC

Entrada aceite: RNA total (recomendado ≥50 µg a ≥180 ng/µL; utilizável 20–80 µg, dependente do estudo).
Verificação de integridade (Bioanalyzer/TapeStation), triagem de contaminantes, conteúdo de rRNA; manuseio livre de RNase.
Controles opcionais: spike-ins de ERCC; padrões de metilação para calibração do chamador.
Recomendação: ≥2 réplicas biológicas por condição (≥3 melhora o poder).

2. Seleção de Poly(A)+ / captura personalizada

Padrão: enriquecimento com oligo-dT para mRNA.
Opções: depleção de rRNA ou captura direcionada (por exemplo, painéis de lncRNA/circRNA ou sondas específicas para organismos).

3. Preparação de biblioteca — RNA direto 1D (sem PCR)

Ligação do adaptador poli(T) e proteína motora; sem RT / sem PCR.
A orientação é 3′→5′ por design; a química e a codificação por barras estão documentadas no nosso protocolo validado de sequenciação de RNA direta por Nanopore.

4. Execução de nanoporo e monitorização em tempo real

QC da célula de fluxo, ocupação de poros, monitorização do rendimento em tempo real.
A configuração de execução correspondeu aos alvos de profundidade (tamanho do organismo, complexidade, comparações).

5. Chamadas de base e processamento de sinal

FAST5 bruto → FASTQ com métricas de qualidade.
Extração consciente do sinal do comprimento da cauda poli(A) por leitura e características de modificação (candidatos m6A/m5C/Ψ/I).

6. Manuseio de alinhamento e isoformas

Alinhamento spliced guiado por referência.
Agrupamento de isoformas e desduplicação para mitigar a truncagem 5′ e a multiplicidade de moléculas; utilização do local de poli(A) capturada.

7. Transferência de análises primárias

Saídas estruturadas (BAM/CRAM, GTF/GFF, tabelas de poli(A) por leitura, tabelas de características de modificação) foram passadas para os módulos de análise de sequenciação de RNA direta da Nanopore.

Notas e melhores práticas

Bibliotecas sem PCR reduzem o viés de GC/amp e preservam as modificações de RNA nativas.
É esperada alguma truncagem de 5′; o nosso pipeline de agrupamento garante precisão ao nível dos isoformas.
Módulo de RNA nascente opcional: a marcação com 5-EU permite a identificação de transcritos nascentes, a estimativa da meia-vida e análises de estabilidade.

Plano de Análise Integrada

Flowchart of Nanopore Direct RNA-seq analysis: gene/isoform/modification/nascent modules feed joint analyses to identify key molecules for validation.

Análise Bioinformática de Sequenciação de RNA Direto por Nanoporos

Flowchart of Nanopore Direct RNA-seq analysis: gene/isoform/modification/nascent modules feed joint analyses to identify key molecules for validation.

I. Análise de isoformas

Análise de splicing alternativo
Identificação de transcritos de fusão
Análise da cauda de poli(A)

II. Quantificação de expressão

Quantificação de transcritos
Análise diferencial de transcritos
Enriquecimento funcional (GO/KEGG/GSEA)
Rede de interação proteína-proteína (PPI)

III. Análise de metilação / modificação de RNA

anotação do sítio m6A
Análise de enriquecimento de modificações
Análise diferencial de m6A

IV. Análise quantitativa conjunta da expressão de isoformas

Análise AltTP
Análise da Diversidade Funcional (ADF)
Análise de enriquecimento diferencial

V. Análise de mRNA nascente (opcional)

Identificação de mRNA nascente
Estimativa da meia-vida
análise de correlação da estabilidade do mRNA
Expressão nascent diferencial

O que Vai Receber do Nosso Serviço de Sequenciação de RNA Direto por Nanoporos

Key outputs and benefits of Nanopore Direct RNA Sequencing, including comprehensive data, functional insights, visualizations, transparent records, and optional add-ons.

Saídas Diretas de RNA Abrangentes

Conjuntos de dados totalmente processados, incluindo FAST5/FASTQ, BAM/CRAM spliced, GTF/GFF (isoformas novas/conhecidas, TSS/TTS, locais de poli(A)), tabelas de caudas de poli(A), listas de locais de modificação de RNA (m6A/m5C/Ψ/I), chamadas de fusão e contagens a nível de transcrito/TPM—prontos para análise imediata de sequenciação de RNA direta por Nanopore e uso posterior.

Insights Diferenciais e Funcionais

Resultados específicos da condição abrangendo transcritos diferenciais, AltTP/DIU, m6A diferencial e comparações de poli(A), além de enriquecimento GO/KEGG e sobreposições de rede PPI opcionais para vincular alterações de isoforma/modificação com vias.

Visualizações Prontas para Publicação

Figuras de alta qualidade: mapas de calor de isoformas, gráficos de vulcão, visuais sashimi/AltTP/DIU, painéis de pontos de quebra de fusão, visualizações de metagene/motivo de modificação e histogramas de poli(A)—otimizados para interpretação e submissão a revistas.

Registos de Análise Transparente

Um relatório conciso de Métodos e QC (resumo do protocolo Direct RNA 3′→5′, software/versões/parâmetros, métricas de rendimento/leitura-Q/mapeamento/junção) com manifesto de pipeline, ficheiro de ambiente e somas de verificação para total reprodutibilidade.

Adicionais Opcionais

Módulo de RNA nascente (identificação de 5-EU, meia-vida, correlações de estabilidade), multi-ómica integrativa (por exemplo, profundidade Illumina + características de RNA direto), estratégias de captura não poli(A), painéis interativos em HTML e exportações personalizadas (por exemplo, prontas para Cytoscape).

Requisitos de Amostras e Envio

Categoria	Requisitos e Notas
Entrada Padrão	RNA totalrecomendado ≥50 µg a ≥180 ng/µL; utilizável 20–80 µg (dependente do objetivo). Guia de célulasCerca de 1×10^7 células normalmente produzem RNA suficiente. tipo de RNAmRNA Poly(A)+ por defeito; opções não-poly(A) disponíveis (captura personalizada/semelhante ao NERD).
Critérios de Qualidade	IntegridadeRIN ≥7 ou alta DV200. Limpezaevitar a contaminação por fenol/EDTA e inibidores de DNase.
Replicados e Controles	Replicados≥2 biológicos por condição (≥3 preferido para diferencial/AltTP). Controles (opcional): Spike-ins ERCC, padrões de metilação (para calibração do chamador de modificações).
Submissão e Envio	EmbalagemTúbulos livres de RNase, claramente rotulados (ID do projeto, ID da amostra, concentração, volume). Temperaturaenviar em gelo seco. Manifesto: incluir metadados de amostra (organismo, tratamento, comparações pretendidas). Conformidade: seguir as regulamentações internacionais de biospecimens; incluir SDS se necessário.
Baixo Input / Casos Especiais	Consulte-nos para estratégias de RNA de baixo input, painéis de captura direcionada (lncRNA/circRNA) ou tecidos degradados/arquivados (viabilidade caso a caso).

Aplicações e Instantâneas de Casos

Aplicações principais

Transcriptómica resolvida por isoformasisoformas de comprimento total, splicing alternativo (AltTP/DIU), utilização de TSS/TTS e sítios poli(A).
Deteção de transcritos de fusãoevidência de molécula única através de pontos de ruptura para chamadas de alta confiança.
Epitranscriptómicamapeamento de modificações de RNA em todo o transcriptoma (m6A/m5C/Ψ/I) com análise diferencial.
Biologia da cauda poli(A)comprimento da cauda poli(A) pré-lido para estudar a estabilidade e a tradução; diferenças específicas de isoforma.
RNA nascente e degradação (opcional)5-EU–baseado RNA nascente, estimativa da meia-vida, correlações de estabilidade.
RNA não codificanteDescoberta/quantificação de lncRNA e circRNA com leituras longas.
Anotação do genomatranscrições/gene novos em organismos não modelo ou tecidos heterogéneos.
Dinâmica longitudinalmudanças simultâneas na estrutura, expressão e modificações ao longo do tempo ou em condições.

Instantâneas de casos

RNA viralmapeamento de m6A a nível base em genomas de comprimento total para relacionar modificações com splicing/isoformas.
Modelos de vírus da hepatitedetecção direta de m5C em RNAs virais para explorar vias de exportação e de deteção inata.
Oncologiadinâmica da pseudouridina (Ψ) ligada ao controlo da tradução; transcritos de fusão em amostras tumorais.
Respostas das plantas à luzleituras de comprimento completo revelam eventos de splicing pós-transcricional regulados pela luz.
Estados metabólicosmudanças específicas de tecido nos poli(A) e troca de isoformas durante o jejum/alimentação.
Fisiologia do stressA profilagem sanguínea longitudinal mostra alterações simultâneas na expressão e nas marcas de m6A.

Core applications and specific case snapshots demonstrating the versatility of Nanopore Direct RNA Sequencing.

Comparação de Métodos

Recurso	Leitura Curta IlluminaRNA-seq	ONT cDNA Long-Read (RT/PCR)	ONT RNA Direto (Este Serviço)
Leitura de moléculas	fragmentos de cDNA	cDNA de comprimento completo (amplificado)	RNA nativo, molécula única
Isoformas de comprimento total	Inferido/ambíguo	Sim	Sim (sem montagem)
Variação de RT/PCR e efeitos de GC	Presente	Presente (reduzido vs SR)	Mínimo (sem PCR)
Modificações de RNA	Indireto/específico de ensaio	Perdido durante o RT	Sinais diretos de m6A/m5C/Ψ/I
Comprimento da cauda de poli(A)	Não acessível	Indireto/não por leitura	Comprimentos de cauda pré-lidos
Deteção de transcritos de fusão	Desafiador (montagem)	Bom	Alta confiança (leitura única através do ponto de ruptura)
Fidelidade de quantificação	Afetado pela fragmentação/modelagem	Viés de RT/PCR possível	Nativo, específico de fita, viés reduzido
Rendimento	Mais alto	Moderado	Lower vs cDNA (maior detalhe por molécula)
Melhor para	Cohortes muito grandes; DE a nível de gene	Isoformas em alta quantidade (sem modificações)	Isoformas + modificações + poli(A) nas mesmas moléculas
Uso típico	Triagem de expressão, DE em massa	Catálogos de isoformas, UTRs longas	Estudos focados em mecanismos: splicing/AltTP, epitranscriptoma, estabilidade

Por que a CD Genomics?

Why CD Genomics—icons for native-RNA expertise, end-to-end workflow, validation, quality, tailored design, and secure RUO delivery.

1. especialização em RNA nativo
RNA direta 1D, sem PCR, orientação 3′→5′; protocolo de sequenciamento de RNA direto Nanopore validado com rigoroso controlo de qualidade de amostra/corrida.

2. Fluxo de trabalho e análise de ponta a ponta
Desde o controlo de qualidade da amostra e preparação da biblioteca até à sequenciação, análise de sequenciação direta de RNA por Nanopore e relatórios integrados—isoformas, m6A/m5C/Ψ/I, cauda poli(A)se RNA nascente opcional.

3. Comprovado em investigação revisada por pares
Bibliotecas de RNA direto de nanoporo preparadas pela CD Genomics foram utilizadas em um estudo da PLOS Genetics sobre Arabidopsis epitranscriptómica, demonstrando o mapeamento de m6A a nível de molécula única com DRS (Sun et al., 2022).

4. Qualidade e reprodutibilidade
Métodos transparentes e relatório de QC, pipelines com versão bloqueada, manifestos e somas de verificação; figuras prontas para publicação e pacotes de dados reutilizáveis.

5. Projetado para a sua pergunta
Desenho do estudo para isoformas/esplicing, epitranscriptoma, biologia do poli(A), RNA nascente; opções para captura não poli(A) e integração multi-plataforma.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

A heatmap visualizing differential isoform expression.

Mapa de Calor da Expressão de Isoformas Diferenciais

A chart illustrating the distribution of m6A sites across different transcript regions.

Distribuição de locais m6A nas regiões de transcritos

A volcano plot showing differential isoform expression.

Gráfico de Vulcão de Isoformas Diferenciais

Logo do Motivo de Sequência m6A

A plot showing the sequence coverage depth at a specific gene locus.

Cobertura de Sequência em um Locus Gênico

Referência:

Sol, Bin, et al. "A metilação mediada por FIONA1 da 3'UTR do FLC afeta os níveis de transcritos de FLC e a floração em Arabidopsis.. PLoS Genética 18.9 (2022): e1010386.

Perguntas Frequentes

Q1. Quando é que o RNA direto não é a primeira escolha para análise?

Para ecrãs de expressão diferencial a nível de genes em orçamentos apertados, cDNA/Illumina geralmente oferece mais profundidade por dólar. O rendimento do RNA direto é mais baixo e o custo por leitura utilizável é mais alto, por isso é melhor reservado para questões onde as características do RNA nativo são importantes—isoformas de comprimento total, splicing alternativo, transcritos de fusão, modificações de RNA e biologia da cauda poli(A).

Q2. Como é que a sequenciação de RNA direta por Nanopore difere da sequenciação de RNA tradicional?

A RNA-seq tradicional converte RNA em cDNA e amplifica-o por PCR, o que pode introduzir viés e remover marcas químicas nativas. A leitura de RNA direta por Nanopore lê moléculas de RNA nativas diretamente na orientação 3′→5′ sem RT/PCR, preservando as modificações do RNA e permitindo medições de caudas poli(A) por leitura, juntamente com isoformas de comprimento total.

Q3. Quais são os principais desafios da RNA Direta?

A RNA direta tem atualmente um menor rendimento do que a cDNA e uma maior taxa de erro em leituras únicas do que a Illumina, além de requerer uma análise especializada e consciente do sinal, bem como um cálculo adequado. Na prática, mitigamos essas limitações com um design experimental apropriado, consenso entre as leituras, alinhamento robusto e controlo de qualidade cuidadoso.

Q4. A RNA direta pode fazer análise de expressão génica, isoformas de splicing e transcritos de fusão?

Sim, desde que o estudo seja concebido para estes objetivos. Rotineiramente quantificamos transcritos, analisamos o uso de isoformas (AltTP/DIU) e detetamos transcritos de fusão com evidência de molécula única; no entanto, para coortes muito grandes focadas apenas na DE a nível de gene, cDNA/Illumina pode ser mais económico, enquanto o RNA Direto é preferido para estudos orientados por mecanismos onde as características do RNA nativo são críticas.

Q5. Podem as caudas de poli(A) e as modificações de RNA ser perfiladas na mesma corrida?

Sim. Tanto o comprimento da cauda poli(A) como as assinaturas de modificação, como m6A, m5C e Ψ/inosina, são derivadas do mesmo sinal de nanoporo em RNA nativo, permitindo uma interpretação conjunta nas próprias moléculas que transportam as características.

Q6. A técnica de RNA direto é específica para a cadeia de RNA, e quanto à truncagem 5′?

As leituras são inerentemente específicas de cadeia e prosseguem de 3′ para 5′ a partir de um adaptador poli(T). Algumas leituras são truncadas a 5′ devido à química e à dinâmica do poro; os nossos passos de agrupamento de isoformas e de desredundância levam isso em conta, de modo que as chamadas a nível de isoforma permaneçam fiáveis.

Q7. Que entrada preciso?

Recomendamos ≥50 µg de RNA total a ≥180 ng/µL, com uma faixa utilizável de 20–80 µg dependendo dos objetivos e da qualidade; RNA intacto (por exemplo, RIN ≥ 7 ou alto DV200) melhora significativamente os resultados. Consulte os Requisitos de Amostra para detalhes sobre envio e controlo de qualidade.

Q8. As leituras de RNA direto de Nanopore detetam m6A diretamente?

Sim. Porque o RNA nativo passa pelo poro sem RT/PCR, o m6A produz assinaturas de corrente características que podem ser chamadas a uma resolução próxima do nível de base e ligadas a transcritos e isoformas específicos.

Q9. Quanto RNA é necessário para a sequenciação direta de RNA da ONT?

A maioria dos projetos visa ≥50 µg de RNA total a ≥180 ng/µL; estudos com 20–80 µg podem ser viáveis dependendo dos objetivos e da integridade do RNA, que influencia fortemente o rendimento e a profundidade da análise.

Q10. Como é que o RNA direto difere do RNA cDNA de leitura longa ou do RNA-seq de leitura curta da Illumina?

As leituras de RNA direto leem RNA nativo (3′→5′) sem RT/PCR, preservando modificações do RNA e permitindo poli(A) por leitura. cDNA/leitura curta perdem modificações nativas e inferem isoformas a partir de fragmentos.

Destaque de Publicação do Cliente

metilação mediada por FIONA1 do 3'UTR de FLC afeta FLC níveis de transcrição e floração em Arabidopsis

Diário: PLoS Genética
Autor: Sun, B., Bhati, K. K., Song, P., et al.
Publicado27 de setembro de 2022

1) Contexto

Tempo de floração em Arabidopsis thaliana é rigidamente controlado por camadas regulatórias de RNA, incluindo N6-metiladenosina (m6A). Sun et al.investigou se o escritor m6A FIONA1 (FIO1; semelhante ao METTL16) adiciona marcas de metilo ao 3′UTR de FLC e, assim, estabiliza o transcrito. Para obter uma visão imparcial e de molécula única da metilação de RNA e da cobertura de isoformas, a equipa integrou a Illumina. RNA-seq, MeRIP-seqe Sequenciação de RNA Direta por Nanopore (DRS).

2) Métodos

Amostras: 14 dias Arabidopsis thaliana mudas (WT Col-0; fio1-1, fio1-5).
Preparação de biblioteca: Protocolo ONT SQK-RNA002 Direct RNA; bibliotecas preparadas pela CD Genomics.
Sequenciação: PromethION (R9.4), corridas de ~48–72 h.
Basecalling/QC: Guppy v3.2.6; filtragem com NanoFilt.
Alinhamento e correção: mapeamento minimap2; correção Fclmr2; métricas através do samtools.
chamada m6A e estatísticas: Tombo (de novo) + MINES; metilação diferencial com methylKit.

3) Resultados

A análise de sequenciação direta de RNA por nanopore revelou alterações no transcriptoma dependentes do genótipo e um consenso de m6A em Arabidopsis de RGACH. No tipo selvagem, a maioria dos eventos de m6A ocorreu em GGACA (34,7%), seguido por AGACT (27,2%), GGACT (22,9%) e GGACC (15,2%). Através fio1 mutantes, o DRS identificou 74 genes hipometilados (fio1-1) e 63 (fio1-5) em relação ao WT. Criticamente, a cobertura do DRS confirmou a depleção de FLC mRNA em fio1-1 e fio1-5, consistente com a perda da metilação do 3′UTR.

4) Conclusões

Este estudo demonstra como a Sequenciação de RNA Direto por Nanoporos fornece evidências de molécula única e comprimento total que ligam o m6A do 3′UTR à estabilidade do mRNA. Ao preservar o RNA nativo, a DRS acopla diretamente a deteção de locais de m6A, a descoberta de motivos e a cobertura a nível de isoforma—resolvendo que o FIO1 instala m6A em FLC 3′UTR, e que a perda desta marca leva a uma rápida FLC decomposição e floração precoce.

Direct RNA-sequencing analysis Result display. Análise de sequenciação de RNA direta.

Aqui estão algumas publicações que foram publicadas com sucesso utilizando os nossos serviços ou outros serviços relacionados:

A metilação do 3'UTR do FLC mediada por FIONA1 afeta os níveis de transcritos de FLC e a floração em Arabidopsis.

Revista: PLoS Genetics

Ano: 2022

Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei prazer em ajudar com a tradução.

O escritor de m6A FIONA1 metila a 3'UTR do FLC e controla a floração em Arabidopsis.

Revista: bioRxiv