Diretrizes para Submissão de Amostras
Por que a Sequenciação Completa de LncRNA é Importante
Os longos RNAs não codificantes (lncRNAs) são transcritos com mais de 200 nt que regulam a expressão génica, o desenvolvimento, a epigenética e as vias da doença. As suas funções são frequentemente específicas de tipo celular e altamente dependentes do splicing alternativo. No entanto, a sequenciação de leituras curtas fragmenta o RNA em pequenas partes, tornando difícil reconstruir isoformas completas ou quantificá-las com precisão.
Sequenciação de LncRNA de Comprimento Total com Nanoporos resolve este problema gerando leituras que abrangem todo o transcrito do 5' ao 3'. Isso permite que os investigadores identifiquem lncRNAs novos, resolvam junções de splicing e quantifiquem isoformas diretamente—oferecendo uma visão mais completa do transcriptoma.
A Nossa Solução de Sequenciação de LncRNA de Comprimento Total com Nanopore
A plataforma da CD Genomics integra tecnologia avançada. Tecnologia de leitura longa da Oxford Nanopore com preparação de bibliotecas de RNA otimizada para fornecer informações precisas a nível de isoforma sobre o transcriptoma de lncRNA.
Parâmetros Técnicos
- RNA total (≥2 µg, RIN ≥7, rRNA depletado)
- Comprimento da leitura: até 10–20 kb de leituras contínuas de moléculas únicas.
- Cobertura: sequenciação de transcritos únicos de 5' a 3' sem fragmentação
- Rendimento: milhões de leituras por execução, escalável para grandes transcriptomas
- Saídas de dados: FASTQ, alinhamento BAM/GTF, anotações de isoformas, matrizes de quantificação
Vantagens Técnicas
- Cobertura de transcrição completa – sequenciação direta de lncRNAs inteiros, eliminando a necessidade de montagem.
- Resolução de splicing – identificação fiável de skipping de exões, retenção de intrões e variantes de splicing complexas
- Quantificação a nível de isoforma – medição mais precisa da expressão em comparação com abordagens de leituras curtas.
- Deteção ampla de RNA – captura de lncRNA, mRNA, tRNA e RNA pequeno dentro do mesmo conjunto de dados.
- Deteção independente de Poly(A) – permite a descoberta de lncRNAs não poliadenilados frequentemente perdidos por métodos convencionais.
Problemas Resolvidos para Investigadores
- Ultrapassa as limitações de leituras curtas – evita a reconstrução incompleta de isoformas causada por sequenciação fragmentada.
- Melhora a precisão na descoberta de biomarcadores – deteta lncRNAs raros ou novos relevantes para doenças e desenvolvimento.
- Suporta insights mecanísticos – clarifica como os isoformas e os eventos de splicing regulam processos biológicos.
- Expande a anotação do transcriptoma – identifica transcritos não caracterizados para enriquecer bases de dados genómicas.
Construção de Bibliotecas de LncRNA de Leitura Curta vs. de Comprimento Completo
Uma comparação clara de sequenciação de RNA de leitura curta e Sequenciação de lncRNA de comprimento completo com nanopore destaca como a tecnologia de leitura longa fornece insights mais fiáveis sobre o transcriptoma.
| Recurso | Construção de Biblioteca de LncRNA de Leitura Curta | Construção de Biblioteca de LncRNA de Comprimento Total com Nanopore |
|---|---|---|
| Processamento de RNA | RNA total → remoção de rRNA ou enriquecimento de poli(A) → fragmentação de RNA | RNA total → remoção de rRNA → integridade do RNA preservada, sem fragmentação |
| Preparação da Biblioteca | Priming aleatório, síntese de cDNA, múltiplos ciclos de PCR, ligação de adaptadores | Síntese de cDNA de comprimento total, amplificação mínima, ligação de adaptadores para Nanopore |
| Comprimento e Cobertura da Leitura | Fragmentos de 50–300 bp; requer montagem computacional. | Leituras contínuas de 10–20 kb que abrangem transcritos do 5' ao 3' |
| Deteção de Isoformas e Splicing | Previsto pela assembleia; muitos eventos permanecem por resolver. | Deteção direta de verdadeiros pontos de splicing, skipping de exões e diversidade de isoformas |
| Precisão de Quantificação | Contagens de fragmentos propensas a viés, especialmente para transcritos longos ou de baixa abundância. | Quantificação a nível de isoforma com perfis de expressão consistentes e reproduzíveis. |
| Descoberta de Transcrições de Romances | Limitado a anotações conhecidas e lncRNAs poli(A)+ | Detecta lncRNAs não anotados e não poli(A) com ampla cobertura de RNA. |
| Fontes de Viés e Erro | A fragmentação e a PCR introduzem erros de montagem e viés 3'/5'. | Taxa de erro bruto mais elevada, mas viés de montagem reduzido; corrigido através de bioinformática. |
| Aplicações Típicas | Expressão diferencial de genes, estudos de genes conhecidos | Descoberta de isoformas, análise de splicing, identificação de biomarcadores, anotação de lncRNA novel. |
Por Que Esta Comparação É Importante
A sequenciação tradicional de leituras curtas é poderosa para estudos de expressão a nível de genes, mas tem dificuldades com reconstrução de isoformas e detecção de splicing alternativo. Em contraste, Sequenciação de lncRNA de comprimento total com nanopore fornece cobertura de leitura contínua em todo o conteúdo, permitindo quantificação precisa de isoformas, descoberta de lncRNA novel, e insights mecanísticos na regulação do transcriptoma.
Aplicações em Pesquisa
A sequenciação de LncRNA de comprimento total por nanopore suporta uma ampla gama de estudos biológicos e biomédicos:
Biologia do Desenvolvimento – construir atlas de lncRNA através de tecidos, espécies e estágios de diferenciação
Oncologia – descobrir biomarcadores a nível de isoforma e regulação de splicing na progressão do câncer
Neurociência e Imunologia – analisar a regulação de lncRNA na resposta imune e nos processos neurais
Toxicologia Ambiental – acompanhar as alterações na expressão de lncRNA sob exposição a produtos químicos ou poluentes
Biologia Evolutiva – identificar motivos conservados, sORFs e locais de ligação de miRNA em novos lncRNAs
Fluxo de Trabalho do Serviço
Da consulta aos resultados, a CD Genomics oferece uma solução completa:
Consulta de projeto – design adaptado aos seus objetivos de investigação
Amostra de QC – Depleção de rRNA e controlo de qualidade do RNA
Preparação da biblioteca – síntese de cDNA de comprimento total e ligação de adaptadores
Sequenciação por nanoporo – cobertura em longo formato de isoformas de lncRNA
Bioinformática – anotação de isoformas, quantificação, insights funcionais
Entrega de dados – dados brutos, ficheiros processados, relatórios anotados
Análise Bioinformática de Sequenciação de lncRNA de Comprimento Total com Nanoporos
O nosso fluxo de trabalho de análise padrão inclui várias etapas-chave: controlo de qualidade, alinhamento, montagem, filtragem, quantificação, análise diferencial de lncRNA, análise diferencial de mRNA, previsão de mRNA alvo de lncRNA e enriquecimento funcional. No cerne desta análise está a avaliação das diferenças na expressão génica para significância estatística. Comparamos a expressão génica entre duas ou mais condições (por exemplo, tratamento vs. controlo), identificamos genes expressos diferencialmente associados a condições específicas e investigamos mais a fundo a significância biológica desses genes.
- Análise de Associação lncRNA-mRNA
As lncRNAs regulam a expressão de genes-alvo através da co-localização ou co-expressão. Para a análise de associação lncRNA-mRNA, a CD Genomics utiliza uma abordagem de análise de interseção: comparando os genes-alvo de lncRNAs diferencialmente expressos com mRNAs diferencialmente expressos. Quando um gene-alvo de um lncRNA diferencialmente expresso é também um mRNA significativamente diferencialmente expresso, é mais provável que seja regulado direta ou indiretamente pelo lncRNA.
- Análise de Associação entre LncRNA e miRNA
As lncRNAs podem conter locais de ligação a miRNAs, permitindo que os miRNAs se liguem às lncRNAs e influenciem a sua função. De acordo com a teoria do RNA endógeno competitivo (ceRNA), os miRNAs podem ligar-se às lncRNAs através do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), levando à degradação das lncRNAs. Para prever lncRNAs-alvo para os miRNAs, utiliza-se software bioinformático para identificar lncRNAs alvo de miRNAs expressos diferencialmente.
- Análise de Associação de LncRNA, miRNA e mRNA
As lncRNAs possuem locais de ligação para miRNAs e podem competir com mRNAs na ligação a miRNAs, inibindo a regulação mediada por miRNAs dos genes-alvo. Isso regula indiretamente a expressão gênica. Com base na teoria ceRNA, identificamos pares de lncRNA-gene alvo que compartilham locais de ligação para miRNA idênticos. Isso nos permite construir redes regulatórias lncRNA-miRNA-mRNA, onde os lncRNAs atuam como iscas, os miRNAs como o núcleo e os mRNAs como os alvos.
Por que fazer parceria com a CD Genomics
- Mais de uma década de experiência em sequenciação de próxima geração e sequenciação de longas leituras.
- Histórico comprovado com tecnologias Oxford Nanopore
- Equipa de bioinformática dedicada, especializada em análise de transcriptoma.
- Soluções flexíveis, apenas para uso em investigação, para academia, biotecnologia e farmacêutica.
- Qualidade de dados fiável, padrões de grau CRO e entrega de dados segura.
Entregáveis
Você receberá:
- Ficheiros de dados brutos (FASTQ)
- Ficheiros de alinhamento processados (BAM/GTF)
- Tabelas de anotação de isoformas e quantificação de expressão
- Relatório de análise abrangente (PDF + Excel)
- Visualizações das estruturas de isoformas e eventos de splicing
Requisitos de Amostra
RNA total: ≥ 2 µg, RIN ≥7, OD260/280 = 1,8–2,0
Tipos de amostras aceites: tecidos, células cultivadas, RNA derivado de sangue, FFPE mediante consulta.
Envio: Envie amostras em gelo seco para preservação da integridade do RNA.
Perguntas Frequentes (FAQ)
Q1. Por que escolher o sequenciamento Nanopore de comprimento completo em vez do RNA-seq de leituras curtas da Illumina?
O Nanopore captura isoformas completas e resolve eventos de splicing, evitando artefatos de montagem provenientes de leituras fragmentadas.
Q2. Podem ser detectadas lncRNAs não poli(A)?
Sim. O nosso protocolo não depende do enriquecimento de poli(A), permitindo uma cobertura de transcritos mais ampla.
Q3. Qual a profundidade de sequenciação recomendada?
Recomendamos 10–20 milhões de leituras para o perfilamento padrão do transcriptoma, com maior profundidade para lncRNAs de baixa abundância.
Q4. Você fornece suporte em bioinformática?
Sim. Fornecemos análise a nível de isoforma, quantificação, anotação funcional e pipelines personalizados adaptados ao seu estudo.
Q5. Que outros serviços de Nanopore você oferece?
Nós também oferecemos Sequenciação de Alvo por Nanoporos e opções de perfilagem multi-transcrição.
Resultados da Demonstração
Resultados da Demonstração Integrada de Sequenciação de LncRNA de Comprimento Total por Nanopore
Perguntas Frequentes sobre Sequenciamento de Lncrna de Comprimento Total com Nanopore
O que é "sequenciação de lncRNA de comprimento total" e como difere da RNA-seq padrão?
O sequenciamento de lncRNA de comprimento completo refere-se a estratégias de sequenciamento (tipicamente através de tecnologias de leitura longa) projetadas para capturar transcritos desde a extremidade 5' através de junções de splicing até a extremidade 3', de modo a obter a isoforma completa sem depender fortemente da montagem de fragmentos curtos. O RNA-seq padrão (de leitura curta) muitas vezes requer a fragmentação do RNA em pedaços, montando as leituras computacionalmente, o que pode perder variantes de splicing, limites de exões, início ou fim da transcrição, e transcritos de baixa abundância. O sequenciamento de comprimento completo melhora a deteção de novas isoformas, o mapeamento preciso de junções de splicing e a quantificação de transcritos completos.
Precisa de uma qualidade de amostra especial para o sequenciamento de lncRNA de comprimento total com Nanopore?
Sim, a qualidade da amostra tem um forte impacto: o RNA total deve ter alta integridade (baixa degradação), boa pureza (baixa contaminação por proteínas, fenol ou sal) e remoção eficiente de rRNA. Como as leituras completas são mais sensíveis a quebras de RNA, começar com RNA intacto melhora o rendimento de transcritos completos. Transcritos de baixa abundância e longos são especialmente vulneráveis à degradação.
Podemos detectar lncRNAs novos ou variantes de splicing que não estão na anotação de referência?
Absolutamente. Uma das principais forças do sequenciamento de lncRNA de comprimento completo é a sua capacidade de descobrir transcritos não anotados, junções de splicing anteriormente não reconhecidas e novas isoformas. Como as leituras cobrem completamente a estrutura dos exões (incluindo locais de splicing alternativo), é possível identificar variantes que métodos de leitura curta frequentemente perdem.
Qual é a precisão da quantificação de expressão com sequenciação de lncRNA de comprimento completo em comparação com a sequenciação de leituras curtas?
A quantificação da expressão é mais fiável ao nível do isoforma quando se têm leituras completas, pois minimiza o viés da montagem, do comprimento dos fragmentos e da fragmentação. Embora as taxas de erro a nível de base possam ser um pouco mais elevadas nas tecnologias de leitura longa, ferramentas de correção e alinhamento a montante permitem uma quantificação muito boa, especialmente para transcritos de expressão moderada a alta.
Quais tipos de RNA podem ser capturados nesta sequenciação? Tem que ser lncRNAs com cauda poli(A)?
Você pode capturar um amplo espectro: lncRNAs poli(A), lncRNAs não poli(A), mRNAs e outros transcritos longos não codificantes, dependendo do protocolo de preparação da biblioteca (por exemplo, remoção de rRNA em vez de enriquecimento de poli(A)). Os lncRNAs não poli(A) geralmente requerem remoção de rRNA + métodos personalizados de iniciação ou ligação de adaptadores.
Quais são os comprimentos de leitura típicos e a qualidade de saída para este serviço?
Leituras típicas de comprimento completo abrangem todo o comprimento dos transcritos (vários kb de comprimento), dependendo do comprimento do transcrito e da qualidade do RNA de entrada. A qualidade inclui deteção consistente de junções de splicing, cobertura desde as extremidades 5' até 3', e baixo viés de fragmentação. A saída inclui leituras brutas, isoformas alinhadas e estimativas de expressão reprodutíveis.
Este tipo de sequenciação é adequado para descobrir biomarcadores novos ou em investigação translacional / clínica?
Sim. Porque o sequenciamento de lncRNA de comprimento total resolve toda a estrutura do isoforma e permite a deteção de transcritos ou variantes de splicing previamente não anotados, é altamente valioso para a descoberta de biomarcadores, estudos de mecanismos de doenças e investigação translacional. Com o manuseio adequado das amostras, validação e pipelines de bioinformática, os resultados podem apoiar ensaios subsequentes ou a validação de marcadores diagnósticos.
Estudos de Caso de Sequenciação de Lncrna de Comprimento Total com Nanopore
Referência: Yu J, Qiu K, Sun W, et al. Uma longa RNA não codificante funciona na acumulação de antocianinas induzida por luz intensa em maçã, ativando a síntese de etileno.. Fisiologia Vegetal. 2022;189:66–83. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei prazer em ajudar com a tradução.
1. Contexto
Os pigmentos antocianinas determinam a coloração vermelha das cascas de maçã, influenciando diretamente a qualidade da fruta e a preferência do consumidor. Embora a luz e o etileno sejam reguladores conhecidos, os mecanismos moleculares que ligam esses sinais permaneciam pouco claros. O estudo investigou se RNAs long não codificantes (lncRNAs) contribuir para a regulação da biossíntese de antocianinas durante a exposição a altas luzes na maçãMalus domestica).
2. Métodos
Sequenciação do transcriptoma de cascas de maçã expostas a diferentes condições de luz foi realizada para identificar lncRNAs responsivos à luz.
Análise de rede de co-expressão gênica ponderada (WGCNA) identificou o MdLNC610 como altamente correlacionado com a produção de antocianinas e etileno.
A validação funcional incluiu:
- Análise de expressão por RT-qPCR sob tratamentos com luz e inibidores.
- Sobrerregulação e silenciamento de MdLNC610 e MdACO1 em frutos de maçã e calos utilizando transformação mediada por Agrobacterium.
- Captura de conformação da cromatina Hi-C para avaliar a proximidade física entre MdLNC610 e MdACO1.
3. Resultados
O tratamento com luz intensa aumentou significativamente tanto a acumulação de antocianinas como a produção de etileno em frutos de maçã.
A expressão de MdLNC610 foi induzida por luz intensa e correlacionou-se positivamente com MdACO1, um gene chave na biossíntese de etileno.
A superexpressão de MdLNC610 levou a níveis mais elevados de etileno e a uma coloração vermelha mais intensa, enquanto o silenciamento suprimiu a pigmentação.
Os dados Hi-C confirmaram a associação física entre MdLNC610 e MdACO1, sugerindo um mecanismo regulatório cis ou trans.
Validação funcional do lncRNA MdLNC610: A superexpressão promove a produção de etileno e a acumulação de antocianinas, enquanto o silenciamento suprime a coloração em frutos de maçã sob condições de alta luminosidade.
4. Conclusões
Este caso demonstra que Sequenciação de lncRNA de comprimento total com nanoporo e transcriptómica integrativa podem identificar lncRNAs regulatórios novos como o MdLNC610, que mediama características fisiológicas chave como a coloração da casca da maçã. Ao capturar isoformas completas e resolver padrões de expressão, o sequenciamento de leitura longa fornece informações críticas sobre redes regulatórias de RNA não codificante–mRNA.
Referências:
- Kyle Palos, et al. Identificação e anotação funcional de longas RNAs não codificantes intergénicos em Brassicaceae. Célula Vegetal, 2022.
- Li N, et al. Uma nova lncRNA trans-ativa do ACTG1 que induz a remodelação dos folículos ovariários.Revista Internacional de Macromoléculas Biológicas. 2023
- Yu J, Qiu K, Sun W, et al. Uma longa RNA não codificante funciona na acumulação de antocianinas induzida por luz intensa em maçãs, ativando a síntese de etileno.Fisiologia Vegetal, 2022.
- Lan Z, et al. A interação entre a lncrna snhg6 e a hnrnpa1 contribui para o crescimento do câncer colorretal ao aumentar a glicólise aeróbica através da regulação do splicing alternativo do PKM.Frontiers in Oncology, 2020.
- Cao M X, et al. Identificação de potenciais biomarcadores de RNA não codificante longo para compostos de mercúrio em embriões de zebrafishPesquisa Química em Toxicologia, 2019.
