Diretrizes para Submissão de Amostras
Por que a Sequenciação de LncRNA de Comprimento Completo é Importante
Os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) são transcritos com mais de 200 nt que regulam a expressão génica, o desenvolvimento, a epigenética e as vias da doença. As suas funções são frequentemente específicas de tipo celular e altamente dependentes do splicing alternativo. No entanto, a sequenciação de leituras curtas fragmenta o RNA em pequenas peças, tornando difícil reconstruir isoformas completas ou quantificá-las com precisão.
Sequenciação de LncRNA de Comprimento Total com Nanopore resolve este problema gerando leituras que abrangem todo o transcrito do 5' ao 3'. Isso permite que os investigadores identifiquem lncRNAs novos, resolvam junções de splicing e quantifiquem isoformas diretamente—oferecendo uma visão mais completa do transcriptoma.
A Nossa Solução de Sequenciação de LncRNA de Comprimento Total com Nanopore
A plataforma da CD Genomics integra avançado Tecnologia de leitura longa Oxford Nanopore com preparação de bibliotecas de RNA otimizada para fornecer informações precisas a nível de isoforma sobre o transcriptoma de lncRNA.
Parâmetros Técnicos
- RNA total (≥2 µg, RIN ≥7, rRNA-depletado)
- Comprimento da leitura: até 10–20 kb de leituras contínuas de moléculas únicas.
- Cobertura: sequenciação de transcritos únicos de 5' a 3' sem fragmentação
- Rendimento: milhões de leituras por execução, escalável para grandes transcriptomas
- Saídas de dados: FASTQ, alinhamento BAM/GTF, anotações de isoformas, matrizes de quantificação
Vantagens Técnicas
- Cobertura de transcrição completa – sequenciação direta de lncRNAs inteiros, eliminando a necessidade de montagem.
- Resolução de splicing – identificação fiável de skipping de exões, retenção de intrões e variantes de splicing complexas
- Quantificação a nível de isoforma – medição mais precisa da expressão em comparação com abordagens de leitura curta
- Deteção ampla de RNA – captura de lncRNA, mRNA, tRNA e RNA pequeno dentro do mesmo conjunto de dados
- Deteção independente de Poly(A) – permite a descoberta de lncRNAs não poliadenilados frequentemente perdidos por métodos convencionais.
Problemas Resolvidos para Investigadores
- Supera as limitações de leituras curtas – evita a reconstrução incompleta de isoformas causada por sequenciação fragmentada.
- Melhora a precisão na descoberta de biomarcadores – deteta lncRNAs raros ou novos relevantes para doenças e desenvolvimento.
- Apoia percepções mecanísticas – esclarece como os isoformas e eventos de splicing regulam processos biológicos.
- Expande a anotação do transcriptoma – identifica transcritos não caracterizados para enriquecer bases de dados genómicas.
Construção de Bibliotecas de LncRNA de Leitura Curta vs. Comprimento Total
Uma comparação clara de sequenciação de RNA de leitura curta e Sequenciação de lncRNA de comprimento total com nanopore destaca como a tecnologia de leitura longa fornece insights mais fiáveis sobre o transcriptoma.
| Recurso | Construção de Biblioteca de LncRNA de Leitura Curta | Construção de Biblioteca de LncRNA de Comprimento Total com Nanopore |
|---|---|---|
| Processamento de RNA | RNA total → remoção de rRNA ou enriquecimento de poli(A) → fragmentação de RNA | RNA total → remoção de rRNA → integridade do RNA preservada, sem fragmentação |
| Preparação da Biblioteca | Primagem aleatória, síntese de cDNA, múltiplos ciclos de PCR, ligação de adaptadores. | Síntese de cDNA de comprimento total, amplificação mínima, ligação de adaptadores para Nanopore |
| Comprimento de Leitura e Cobertura | Fragmentos de 50–300 bp; requer montagem computacional. | Leituras contínuas de 10–20 kb que abrangem transcritos do 5' ao 3' |
| Deteção de Isoformas e Splicing | Previsto pela assembleia; muitos eventos permanecem por resolver. | Deteção direta de verdadeiros locais de splicing, skipping de exões e diversidade de isoformas |
| Precisão de Quantificação | Contagens de fragmentos suscetíveis a viés, especialmente para transcritos longos ou de baixa abundância. | Quantificação a nível de isoforma com perfis de expressão consistentes e reproduzíveis. |
| Descoberta de Transcrições Novas | Limitado a anotações conhecidas e lncRNAs poli(A)+ | Detecta lncRNAs não anotados e não poli(A) com ampla cobertura de RNA. |
| Fontes de Viés e Erro | A fragmentação e a PCR introduzem erros de montagem, viés 3'/5'. | Maior taxa de erro bruto, mas redução do viés de montagem; corrigido através de bioinformática. |
| Aplicações Típicas | Expressão diferencial de genes, estudos de genes conhecidos | Descoberta de isoformas, análise de splicing, identificação de biomarcadores, anotação de lncRNA novel. |
Por Que Esta Comparação É Importante
A sequenciação tradicional de leituras curtas é poderosa para estudos de expressão a nível de gene, mas tem dificuldades com reconstrução de isoformas e detecção de splicing alternativoEm contraste, Sequenciação de lncRNA de comprimento completo com nanopore fornece cobertura de leitura contínua em todo o conteúdo, permitindo quantificação precisa de isoformas, descoberta de lncRNA novele insights mecanísticos na regulação do transcriptoma.
Aplicações em Pesquisa
A sequenciação de LncRNA de comprimento total por nanoporo suporta uma ampla gama de estudos biológicos e biomédicos:
Biologia do Desenvolvimento – construir atlas de lncRNA através de tecidos, espécies e estágios de diferenciação
Oncologia – descobrir biomarcadores a nível de isoforma e regulação de splicing na progressão do câncer
Neurociência e Imunologia – analisar a regulação de lncRNA na resposta imune e nos processos neurais
Toxicologia Ambiental – acompanhar as alterações na expressão de lncRNA sob exposição a produtos químicos ou poluentes
Biologia Evolutiva – identificar motivos conservados, sORFs e locais de ligação de miRNA em novos lncRNAs
Fluxo de Trabalho de Serviço
Desde a consulta até aos resultados, a CD Genomics oferece uma solução completa:
Consulta de projeto – design adaptado aos seus objetivos de pesquisa
Amostra de QC – Depleção de rRNA e controlo de qualidade do RNA
Preparação da biblioteca – síntese de cDNA de comprimento total e ligação de adaptadores
Sequenciação por nanopore – cobertura em formato longo de isoformas de lncRNA
Bioinformática – anotação de isoformas, quantificação, insights funcionais
Entrega de dados – dados brutos, ficheiros processados, relatórios anotados
Análise Bioinformática de Sequenciação de lncRNA de Comprimento Total por Nanoporos
O nosso fluxo de trabalho de análise padrão inclui várias etapas-chave: controlo de qualidade, alinhamento, montagem, filtragem, quantificação, análise diferencial de lncRNA, análise diferencial de mRNA, previsão de mRNA alvo de lncRNA e enriquecimento funcional. No cerne desta análise está a avaliação das diferenças na expressão génica em termos de significância estatística. Comparamos a expressão génica em duas ou mais condições (por exemplo, tratamento vs. controlo), identificamos genes expressos diferencialmente associados a condições específicas e investigamos ainda mais a significância biológica desses genes.
- Análise de Associação lncRNA-mRNA
As lncRNAs regulam a expressão de genes-alvo através de co-localização ou co-expressão. Para a análise de associação lncRNA-mRNA, a CD Genomics utiliza uma abordagem de análise de interseção: comparando os genes-alvo de lncRNAs diferencialmente expressos com mRNAs diferencialmente expressos. Quando um gene-alvo de um lncRNA diferencialmente expresso é também um mRNA significativamente diferencialmente expresso, é mais provável que seja regulado direta ou indiretamente pelo lncRNA.
- Análise de Associação entre LncRNA e miRNA
As lncRNAs podem conter locais de ligação para miRNAs, permitindo que os miRNAs se liguem às lncRNAs e influenciem a sua função. De acordo com a teoria do RNA endógeno competitivo (ceRNA), os miRNAs podem ligar-se às lncRNAs através do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), levando à degradação das lncRNAs. Para prever lncRNAs-alvo para miRNAs, utiliza-se software bioinformático para identificar lncRNAs alvo de miRNAs expressos de forma diferencial.
- Análise de Associação de LncRNA, miRNA e mRNA
As lncRNAs possuem locais de ligação para miRNAs e podem ligar-se de forma competitiva a miRNAs com mRNAs, inibindo a regulação mediada por miRNAs dos genes-alvo. Isto regula indiretamente a expressão génica. Com base na teoria ceRNA, identificamos pares de lncRNA-gene alvo que partilham locais de ligação para miRNA idênticos. Isto permite-nos construir redes regulatórias lncRNA-miRNA-mRNA, onde os lncRNAs atuam como iscas, os miRNAs como o núcleo e os mRNAs como os alvos.
Por que fazer parceria com a CD Genomics
- Mais de uma década de experiência em sequenciação de próxima geração e sequenciação de longas leituras.
- Historial comprovado com as tecnologias Oxford Nanopore.
- Equipa de bioinformática dedicada especializada em análise de transcriptoma.
- Soluções flexíveis, apenas para uso em investigação, para academia, biotecnologia e farmacêutica.
- Qualidade de dados fiável, padrões de nível CRO e entrega de dados segura.
Entregáveis
Você receberá:
- Ficheiros de dados brutos (FASTQ)
- Ficheiros de alinhamento processados (BAM/GTF)
- Tabelas de anotação de isoformas e quantificação de expressão
- Relatório de análise abrangente (PDF + Excel)
- Visualizações das estruturas de isoformas e eventos de splicing
Requisitos de Amostra
RNA total: ≥ 2 µg, RIN ≥7, OD260/280 = 1,8–2,0
Tipos de amostras aceites: tecidos, células cultivadas, RNA derivado de sangue, FFPE mediante consulta.
Envio: Envie amostras em gelo seco para preservação da integridade do RNA.
Perguntas Frequentes (FAQ)
Q1. Por que escolher o sequenciamento Nanopore de comprimento completo em vez do RNA-seq de leituras curtas da Illumina?
O Nanopore captura isoformas completas e resolve eventos de splicing, evitando artefatos de montagem provenientes de leituras fragmentadas.
Q2. Podem ser detetadas lncRNAs não poli(A)?
Sim. O nosso protocolo não depende do enriquecimento de poli(A), permitindo uma cobertura de transcritos mais ampla.
Q3. Qual a profundidade de sequenciação recomendada?
Recomendamos 10–20 milhões de leituras para o perfil de transcriptoma padrão, com maior profundidade para lncRNAs de baixa abundância.
Q4. Você oferece suporte em bioinformática?
Sim. Nós fornecemos análise a nível de isoforma, quantificação, anotação funcional e pipelines personalizados adaptados ao seu estudo.
Q5. Que outros serviços de Nanopore você oferece?
Também oferecemos Sequenciação de Alvo por Nanoporos e opções de perfilagem de múltiplos transcritos.
Resultados da Demonstração Integrada de Sequenciação de LncRNA de Comprimento Total por Nanopore
Perguntas Frequentes
O que é "sequenciação de lncRNA de comprimento completo" e como se diferencia da RNA-seq padrão?
O sequenciamento de lncRNA de comprimento completo refere-se a estratégias de sequenciamento (tipicamente através de tecnologias de leitura longa) projetadas para capturar transcritos desde a extremidade 5' através de junções de splicing até a extremidade 3', de modo a obter a isoforma completa sem depender fortemente da montagem de fragmentos curtos. O RNA-seq padrão (de leitura curta) muitas vezes requer a fragmentação do RNA em pedaços, montando as leituras computacionalmente, o que pode perder variantes de splicing, limites de exões, início ou fim da transcrição e transcritos de baixa abundância. O sequenciamento de comprimento completo melhora a deteção de novas isoformas, o mapeamento preciso de junções de splicing e a quantificação de transcritos completos.
Precisa de uma qualidade de amostra especial para sequenciação de lncRNA de comprimento total com Nanopore?
Sim, a qualidade da amostra tem um forte impacto: o RNA total deve ter alta integridade (baixa degradação), com boa pureza (baixa contaminação por proteínas, fenol ou sal) e remoção eficiente de rRNA. Como as leituras de comprimento total são mais sensíveis a quebras de RNA, começar com RNA intacto melhora o rendimento de transcritos completos. Transcritos de baixa abundância e longos são especialmente vulneráveis à degradação.
Podemos detectar lncRNAs novos ou variantes de splicing que não estão na anotação de referência?
Absolutamente. Uma das principais forças do sequenciamento de lncRNA de comprimento completo é a sua capacidade de descobrir transcritos não anotados, junções de splicing anteriormente não reconhecidas e novas isoformas. Como as leituras cobrem completamente a estrutura dos exões (incluindo locais de splicing alternativo), é possível identificar variantes que os métodos de leitura curta frequentemente perdem.
Quão precisa é a quantificação de expressão com sequenciação de lncRNA de comprimento completo em comparação com a de leituras curtas?
A quantificação de expressão é mais fiável ao nível do isoforma quando se têm leituras completas, uma vez que se minimiza o viés proveniente da montagem, do comprimento dos fragmentos e da fragmentação. Embora as taxas de erro a nível de base possam ser algo mais elevadas nas tecnologias de leitura longa, as ferramentas de correção e alinhamento a montante permitem uma quantificação muito boa, especialmente para transcritos de expressão moderada a alta.
Quais tipos de RNA podem ser capturados nesta sequenciação? Tem de ser lncRNAs com cauda poli(A)?
Pode capturar um amplo espectro: lncRNAs poli(A), lncRNAs não poli(A), mRNAs e outros transcritos longos não codificantes, dependendo do protocolo de preparação da biblioteca (por exemplo, remoção de rRNA em vez de enriquecimento de poli(A)). Os lncRNAs não poli(A) frequentemente requerem remoção de rRNA + métodos personalizados de primagem ou ligação de adaptadores.
Quais são os comprimentos de leitura típicos e a qualidade de saída para este serviço?
Leituras típicas de comprimento total abrangem comprimentos inteiros de transcritos (vários kb de comprimento), dependendo do comprimento do transcrito e da qualidade do RNA de entrada. A qualidade inclui deteção consistente de junções de splicing, cobertura desde as extremidades 5' até 3', e baixo viés de fragmentação. A saída inclui leituras brutas, isoformas alinhadas e estimativas de expressão reprodutíveis.
Este tipo de sequenciação é adequado para descobrir biomarcadores novos ou na investigação translacional / clínica?
Sim. Porque o sequenciamento de lncRNA de comprimento total resolve toda a estrutura do isoforma e permite a deteção de transcritos ou variantes de splicing previamente não anotados, é altamente valioso para a descoberta de biomarcadores, estudos de mecanismos de doenças e investigação translacional. Com o manuseio adequado das amostras, validação e pipelines de bioinformática, os resultados podem apoiar ensaios subsequentes ou a validação de marcadores diagnósticos.
Estudo de Caso: Sequenciação de lncRNA de Comprimento Completo por Nanopore Revela Regulação Mediadas por lncRNA da Coloração da Fruta
Referência: Yu J, Qiu K, Sun W, et al. Uma longa RNA não codificante funciona na acumulação de antocianinas induzida por luz intensa em maçãs, ativando a síntese de etileno.. Fisiologia Vegetal. 2022;189:66–83. Desculpe, não consigo acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça o texto que deseja traduzir.
1. Contexto
Os pigmentos antocianinas determinam a coloração vermelha das cascas das maçãs, influenciando diretamente a qualidade da fruta e a preferência do consumidor. Embora a luz e o etileno sejam reguladores conhecidos, os mecanismos moleculares que ligam esses sinais permaneciam pouco claros. O estudo investigou se RNAs não codificantes longos (lncRNAs) contribuir para a regulação da biossíntese de antocianinas durante a exposição a altas luzes na maçãMalus domestica).
2. Métodos
Sequenciação do transcriptoma foi realizada uma análise das cascas de maçã expostas a diferentes condições de luz para identificar lncRNAs responsivos à luz.
Análise de rede de co-expressão gênica ponderada (WGCNA) identificou o MdLNC610 como altamente correlacionado com a produção de antocianinas e etileno.
A validação funcional incluiu:
- Análise de expressão por RT-qPCR sob tratamentos com luz e inibidores.
- Sobreexpressão e silenciamento de MdLNC610 e MdACO1 em frutos de maçã e calos utilizando transformação mediada por Agrobacterium.
- Captura de conformação da cromatina Hi-C para avaliar a proximidade física entre MdLNC610 e MdACO1.
3. Resultados
O tratamento com luz intensa aumentou significativamente tanto a acumulação de antocianinas como a produção de etileno em frutos de maçã.
A expressão de MdLNC610 foi induzida por luz intensa e correlacionou-se positivamente com MdACO1, um gene chave na biossíntese de etileno.
A superexpressão de MdLNC610 levou a níveis mais elevados de etileno e a uma coloração vermelha acentuada, enquanto o silenciamento suprimiu a pigmentação.
Os dados Hi-C confirmaram a associação física entre MdLNC610 e MdACO1, sugerindo um mecanismo regulatório cis ou trans.
Validação funcional do lncRNA MdLNC610: A superexpressão promove a produção de etileno e a acumulação de antocianinas, enquanto o silenciamento suprime a coloração em frutos de maçã sob condições de alta luminosidade.
4. Conclusões
Este caso demonstra que Sequenciação de lncRNA de comprimento total com nanoporo e transcriptómica integrativa pode identificar lncRNAs regulatórios novos como o MdLNC610, que mediama características fisiológicas chave como a coloração da casca da maçã. Ao capturar isoformas completas e resolver padrões de expressão, o sequenciamento de leitura longa fornece informações críticas sobre redes regulatórias de RNA não codificante–mRNA.
Referências:
- Kyle Palos, et al. Identificação e anotação funcional de longas RNAs não codificantes intergénicos em Brassicaceae. Célula Vegetal, 2022.
- Li N, et al. Uma nova lncRNA trans-ativa do ACTG1 que induz a remodelação dos folículos ovarianos.Revista Internacional de Macromoléculas Biológicas. 2023
- Yu J, Qiu K, Sun W, et al. Uma longa RNA não codificante funciona na acumulação de antocianinas induzida por luz intensa em maçãs, ativando a síntese de etileno.Fisiologia Vegetal, 2022.
- Lan Z, et al. A interação entre a lncrna snhg6 e a hnrnpa1 contribui para o crescimento do câncer colorretal ao aumentar a glicólise aeróbica através da regulação do splicing alternativo do PKM.Frontiers in Oncology, 2020.
- Cao M X, et al. Identificação de potenciais biomarcadores de RNA não codificante longo para compostos de mercúrio em embriões de zebrafishPesquisa Química em Toxicologia, 2019.
