Sequenciação de RNA Bacteriano

Além de eucarioto Sequenciação de RNA serviço, a CD Genomics também se dedica a fornecer serviços de sequenciação de RNA procariótico para avançar as suas necessidades de perfilagem de expressão génica bacteriana, utilizando as técnicas mais recentes.

A Introdução do Sequenciamento de RNA Bacteriano

Nos últimos anos, sequenciação de alto rendimento de bibliotecas de cDNA (RNA-Seq) emergiu como uma tecnologia poderosa para perfilar a expressão génica, descobrir genes previamente não anotados e mapear a arquitetura do transcriptoma numa ampla variedade de espécies bacterianas. Com a aplicação de RNA-seq abordagens derivativas, podemos obter insights biológicos sobre o mundo bacteriano e aspirar a desvendar os mistérios relacionados com a expressão génica, organização e outras características genómicas funcionais. O transcriptoma bacteriano e metatranscriptoma as informações são importantes para prever a resistência a antibióticos específicos, compreender as interações imunes entre hospedeiro e patógeno, quantificar as alterações na expressão gênica e acompanhar a progressão da doença.

Existem diferenças óbvias na construção de bibliotecas de cDNA entre RNA-Seq bacteriano e RNA-Seq eucariótico. O primeiro passo do fluxo de trabalho do RNA-Seq bacteriano é a seleção de transcritos de mRNA. A química de redução de RNA ribossómico Ribo-Zero é utilizada em vez da seleção de cauda poli-A, o que torna este método particularmente adequado para o mRNA bacteriano que não possui cauda poli-A. Após a purificação, o mRNA é fragmentado em pequenos pedaços e copiado para cDNA de primeira cadeia usando transcriptase reversa e primers aleatórios. A especificidade da cadeia é alcançada substituindo dTTP por dUTP na Mistura de Marcação da Segunda Cadeia (SMM), seguida pela síntese de cDNA da segunda cadeia. Através do uso de RNA-Seq específico de cadeia, pode-se alcançar uma compreensão mais completa do transcriptoma, o que tem o potencial de identificar novos níveis de regulação da expressão gênica.

Vantagens da Sequenciação de RNA Bacteriano

• Anotação Precisa da Estrutura Génica: Sequenciação do transcriptoma em procariotos podem identificar pequenos peptídeos que podem ser negligenciados na anotação do genoma, fornecendo informações mais precisas sobre a estrutura dos genes.
• Deteção e Anotação de Regiões Regulatórias Não Codificantes de mRNA: O sequenciamento do transcriptoma revela elementos regulatórios importantes no mRNA procariótico, como ribosswitches e locais de ligação de pequenos RNAs, aumentando a nossa compreensão dos mecanismos regulatórios do mRNA.
• Estudo da Estrutura e Função dos Operões: A análise do transcriptoma pode determinar as estruturas dos operões, avançando a nossa compreensão da regulação multifuncional e da evolução dos transcritos policistrónicos.
• Pesquisa sobre a Regulação de RNA Não Codificante: Através do sequenciamento de sRNA procariótico, obtemos informações sobre a função e os mecanismos destes elementos regulatórios no controlo fisiológico.
• Plasticidade das Funções dos Elementos de RNA: O sequenciamento do transcriptoma revela a versatilidade funcional dos elementos de RNA sob diferentes condições, ajudando a compreender os seus papéis em ambientes diversos.

Aplicação da Sequenciação de RNA Bacteriano

• Investigação dos mecanismos moleculares regulatórios de microrganismos relacionados a diferentes estágios, fenótipos e respostas ao stress.
• Melhorar a informação do transcriptoma microbiano, incluindo a determinação da estrutura dos transcritos, a previsão de novos transcritos e a identificação de RNAs não codificantes.
• Nível de expressão génica
• Nível de estrutura do gene
• Função do gene
• Rede de interação
• Identificação de Genes Diferenciais
• Deteção de RNAs não codificantes, etc.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de RNA Bacteriano

As etapas principais envolvidas na Sequenciação de RNA Bacteriano começam com a extração de RNA total de células bacterianas. Esta operação é seguida pela eliminação de rRNA, que predomina no RNA total, para aumentar seletivamente a população de mRNA. Subsequentemente, o mRNA é convertido em DNA complementar (cDNA) através da transcrição reversa. O cDNA resultante é fragmentado, adaptadores são ligados e a amplificação por PCR é executada para formular a biblioteca de sequenciação. A sequenciação de alto rendimento é então realizada utilizando plataformas como Illumina ou PacBio. A fase final abrange um meticuloso processo de análise de dados, que inclui garantia de qualidade, alinhamento de sequências, quantificação e análise de expressão diferencial.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra Quantidade de RNA: RNA total ≥ 1 μg (sem degradação ou contaminação por DNA) Células ≥ 1x107 Relação OD A260/A280 ≥ 1,8, relação A260/230 ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Todas as amostras de RNA total devem estar isentas de DNA. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. Nota: Os montantes de amostra são listados apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciamento HiSeq X dez, 150 PE, 1~3 G por amostra MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400
	Análise Bioinformática Análise ao nível da estrutura do gene Avaliação da qualidade dos dados de sequenciação Filtragem de dados brutos Mapa para o genoma de referência Nova previsão de transcrição Análise de UTR Predição de transcritos antisenso análise de sRNA Deteção e análise de SNPs Análise de InDel Análise do nível de expressão génica Análise do nível de expressão gênica diferencial Anotação GO e KEGG de genes diferenciais. Análise de enriquecimento GO/KEGG de genes diferenciais. Análise de redes de interação de proteínas Exibição de resultados de visualização Nota: Os dados recomendados e os conteúdos da análise apresentados são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de RNA Bacteriano para a sua escrita (personalização)

A CD Genomics oferece uma solução rápida e completa de sequenciação de RNA bacteriano, desde o controlo de qualidade da amostra até à análise abrangente de dados. contacte-nos para mais informações e um orçamento detalhado.

Referências

1. Kröger C, MacKenzie K D, Alshabib E Y, et al. O transcriptoma primário, pequenos RNAs e regulação da resistência antimicrobiana em Acinetobacter baumannii ATCC 17978. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2018, 46(18): 9684-9698.
2. Liu X, Shen B, Du P, et al. Análise transcriptómica da resposta de Pseudomonas fluorescens ao epigalocatequina galato através de RNA-seq. PloS one, 2017, 12(5): e0177938.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição de A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Vulcão

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

1. Por que é necessária a remoção do rRNA?

A remoção meticulosa do RNA ribossómico (rRNA) tem uma importância fundamental na Sequenciação de RNA Bacteriano, devido à sua presença predominante nas amostras de RNA bacteriano, frequentemente superior a 90% do conteúdo total de RNA. Como o RNA mensageiro (mRNA) - o principal alvo dos esforços de sequenciação - constitui apenas uma fração minoritária do total de RNA, a depleção eficaz de rRNA é indispensável para mitigar a abundância esmagadora de sequências de rRNA nos conjuntos de dados de sequenciação. Negligenciar a eliminação do rRNA pode comprometer significativamente a precisão da sequenciação e afetar a sensibilidade da deteção de mRNA.

2. É possível realizar sequenciação do transcriptoma procariótico sem um genoma de referência?

Não, uma vez que não é praticamente viável. O mRNA procariota é frequentemente policistrónico, tornando a montagem direta pouco confiável.

3. Como é que a sequenciação de RNA de célula única difere da sequenciação de RNA bacteriano?

A sequenciação de RNA de célula única destaca-se da sequenciação de RNA bacteriano pela sua ênfase em estudar a expressão génica ao nível de células individuais, expondo variações entre células. Ao contrário da sequenciação de RNA bacteriano, que examina a expressão génica média de uma população bacteriana, a singularidade da sequenciação de RNA de célula única reside nas suas abordagens distintas para a preparação de amostras, análise de dados e potenciais aplicações.

A reivindicação da primazia do intestino humano Bacteroides ovatus na degradação de celobiose dietética

Revista: Micróbios Intestinais
Fator de impacto: 11,724
Publicado: 22 de Jun de 2023

Fundo

A celulose, um constituinte primário das paredes celulares das plantas, não pode ser digerida pelos mamíferos sem a assistência de bactérias celulolíticas. Estas bactérias, que residem nos tratos gastrointestinais de vários animais, incluindo os humanos, desempenham um papel essencial na degradação da celulose, fornecendo assim energia aos seus hospedeiros. Embora um número substancial de bactérias celulolíticas tenha sido identificado, muitas permanecem insuficientemente caracterizadas. Os principais genes responsáveis pela produção de celulase encontram-se predominantemente nas famílias de hidrolases de glicosídeos (GH). Nos humanos, a atividade da celulase foi notavelmente observada em Ruminococcus champanellensis, mas uma investigação mais aprofundada é imperativa para elucidar totalmente os seus mecanismos funcionais. Avanços recentes, utilizando Sequenciação de RNA (RNA-seq) e Sequenciação de rRNA 16Sestão focados em descobrir novas celulases e compreender os processos complexos subjacentes à degradação da celulose no intestino humano.

Métodos

Resultados

Para investigar os PULs responsáveis pela degradação de celobiose, BO co-cultivado com celobiose foi submetido a sequenciamento de RNA. Os resultados revelaram 91 genes com expressão alterada em resposta à celobiose, dos quais 19 foram significativamente regulados para cima em comparação com BO cultivado em glicose. Estes genes regulados para cima foram organizados em dois PULs, PUL1 e PUL2, confirmados por RT-qPCR. O PUL1, composto por 15 genes incluindo hidrolases glicosidases (GH5 e GH2) e seis proteínas hipotéticas, e o PUL2, composto por cinco genes incluindo GH16 e GH3, estão implicados na degradação de celobiose. Notavelmente, o PUL1 não havia sido relatado anteriormente.

Figura 1. Os loci de utilização de polissacarídeos (PULs) foram analisados por RNA-seq e confirmados por RT-qPCR.

Para elucidar as vias específicas pelas quais a degradação de celobiose é facilitada na bactéria, foram isoladas proteínas recombinantes representando cada locus de utilização de polissacarídeos (PUL) e produzidos soro imune para caracterização. Evidentemente, as proteínas BACOVA_02626GH5, BACOVA_02630GH5 e BACOVA_02745GH3 exibiram uma regulação específica em presença de celobiose, implicando a sua participação direta na degradação deste substrato. Através de uma combinação de análises de imunofluorescência e Western blot, foi estabelecido que a BACOVA_02630GH5 se localiza predominantemente na membrana celular, enquanto a BACOVA_02626GH5 e a BACOVA_02745GH3 foram expressas a níveis relativamente mais baixos dentro da célula. Avaliações enzimáticas confirmaram ainda a capacidade da BACOVA_02626GH5, BACOVA_02630GH5 e BACOVA_02745GH3 de catalisar a conversão de celobiose em glicose. Estas observações coletivas sublinham o papel indispensável desempenhado por estas proteínas na via de degradação de celobiose dentro da bactéria.

Figura 2. Foram determinadas duas novas celulases.

Para investigar as atividades funcionais bacterianas, utilizámos o PICRUSt1/2 e o Tax4Fun para mapear sequências de 16S rRNA a genes e vias metabólicas. O agrupamento não supervisionado de 49 vias metabólicas MetaCyc previstas mostrou diferenças significativas entre os grupos de veículo e celobiose, indicando vias metabólicas do microbioma específicas para a celobiose. O Tax4Fun previu que apenas a β-N-acetilhexosaminidase, a alfa-glucosidase e a β-galactosidase diferiam do grupo de veículo. A análise do PICRUSt1 revelou vias KEGG enriquecidas relacionadas com a histidina, metano, vitamina B6 e biossíntese de folato após o tratamento com celobiose. O metabolismo da histidina e a β-N-acetilhexosaminidase demonstraram inibir a inflamação do cólon. O tratamento com celobiose diminuiu os níveis de mRNA e proteína de TNF-α e IL-6 e aumentou a expressão de mRNA de H2R. Estes achados sugerem que a celobiose pode alterar as funções metabólicas bacterianas, embora o seu impacto na inflamação permaneça incerto e exija mais investigação.

Figura 3. Predição da função metabólica de bactérias e deteção de fatores inflamatórios.

Conclusão

As bactérias celulolíticas são cruciais para a degradação da celulose, no entanto, os seus mecanismos moleculares permanecem pouco explorados. A celobiose, uma unidade de celulose, promove o crescimento da bactéria intestinal chave BO, mas o seu mecanismo molecular não está claro. Este estudo identificou duas novas celulases na superfície celular da BO que degradam a celobiose em glicose. Estas celulases, com estruturas semelhantes às enzimas de bactérias do solo, indicam uma adaptação evolutiva. Testes in vivo mostraram que a celobiose remodelou a microbiota intestinal e reduziu a inflamação, sugerindo potenciais propriedades anti-inflamatórias. Esta pesquisa melhora a nossa compreensão da degradação da celulose no intestino humano e destaca a necessidade de uma exploração mais aprofundada das capacidades celulolíticas da microbiota intestinal.

Referência

1. Li M, Wang Y, Guo C, et al. A reivindicação da primazia do Bacteroides ovatus humano no degradação da celobiose dietética. Micróbios Intestinais, 2023, 15(1): 2227434.