Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é o sequenciamento de genoma completo de novo de plantas e animais?
Sequenciação de genomas inteiros de plantas e animais de novo refere-se à montagem de um genoma completo sem depender de qualquer sequência de referência existente. Esta abordagem é essencial ao trabalhar com espécies que não possuem um genoma de referência, têm genomas mal montados ou apresentam características genómicas complexas, como alta heterozigosidade, poliploidia ou extensas regiões repetitivas.
Em vez de alinhar leituras de sequenciamento a um genoma conhecido, a montagem de novo reconstrói o genoma do zero—como resolver um enorme quebra-cabeças usando apenas os fragmentos de sequência gerados por plataformas de sequenciamento de alto rendimento. O resultado é um plano genético de alta resolução que pode ser utilizado para anotação funcional, análise comparativa, melhoramento molecular e estudos evolutivos.
Na CD Genomics, fornecemos serviços de sequenciação de novo de ponta a ponta para uma ampla gama de espécies de plantas e animais. Ao integrar leituras curtas da Illumina, leituras longas HiFi da PacBio, leituras ultra-longas da Nanopore e dados de interação de cromatina Hi-C, entregamos montagens de genomas ao nível de cromossoma pronto para investigação e publicação subsequente.
Quando Deve Utilizar Sequenciação de Genoma De Novo?
O sequenciamento de genoma de novo é a estratégia preferida quando não existe um genoma de referência de alta qualidade — ou quando os referências existentes não podem satisfazer os seus objetivos de investigação. Aqui estão os casos de uso mais comuns:
✅ Nenhum Genoma de Referência Disponível
Para espécies recém-descobertas ou pouco estudadas, o sequenciamento de novo permite que os investigadores gerem uma referência completa a partir do zero.
✅ Referência Incompleta ou Fragmentada
Muitos genomas disponíveis publicamente estão desatualizados, mal montados ou fragmentados ao nível do andaime. A montagem de novo oferece continuidade a nível de cromossoma para investigação de alta resolução.
✅ Genomas Complexos: Poliploidia, Heterozigosidade, Repetições
Os genomas de plantas e animais frequentemente contêm altos níveis de duplicação, variação estrutural ou elementos repetitivos. Abordagens de de novo utilizando sequenciação de leitura longa e mapeamento Hi-C superar estes desafios.
✅ Construção do Pan-Genoma
Quando um único genoma de referência não consegue capturar a diversidade genética de uma espécie, a construção de um pan-genoma através da montagem de novo de múltiplos indivíduos revela variação específica da população.
✅ Descoberta de Características e Melhoramento Molecular
Montagens de alta qualidade fornecem a base para GWAS, mapeamento de QTL, e edição do genoma—especialmente em investigação agrícola, de aquicultura e de pecuária.
Dica Profissional:
O sequenciamento de novo não é apenas para espécies novas. Muitas vezes é o melhor forma de atualizar um genoma de baixa contiguidade a uma qualidade pronta para publicação, especialmente quando combinado com dados HiFi e Hi-C.
Visão Geral da Estratégia Tecnológica: Comparação de Plataformas para Montagem de Genomas
| Plataforma | Papel na Assembleia | Cobertura Típica | Forças | Recomendado Para |
|---|---|---|---|---|
| Illumina / DNBSEQ™ | Inquérito do genoma, correção de erros | 30–50× | Alta precisão, baixo custo, essencial para o perfilamento de k-mer. | Análise inicial da complexidade do genoma |
| PacBio HiFi | Montagem de novo a nível de contig | 30–60× | Precisão ultra-alta (Q20+), excelente para genomas ricos em repetições ou poliploides. | Genomas de plantas/animais com alta heterozigosidade |
| Oxford Nanopore (ONT) | Fecho de lacunas, montagem de leituras ultra-longas | 50–100× | Leituras ultra-longas (>100 kb), ideais para montagens telómero-a-telómero (T2T) | Genomas que requerem continuidade completa ou quase completa |
| Hi-C | Escorçamento em escala de cromossoma | 100–150× | Constrói pseudomoléculas de cromossomas, corrige erros de montagem. | Ancoragem final de cromossomas e QC |
| 10x Genomics Leituras Ligadas | Resolução de repetição, faseamento (opcional) | ~60× | Fases de locos heterozigóticos, suportam a separação de haplótipos. | Espécies diploides ou altamente heterozigóticas |
| Mapeamento Óptico BioNano | Detecção de variações estruturais grandes (opcional) | NA | Deteta SVs, estrutura montagens complexas. | Genomas muito grandes ou estruturalmente complexos |
Insight sobre Estratégia Híbrida:
As montagens mais bem-sucedidas combinam leituras curtas + leituras longas + Hi-C. Adaptamos a combinação de plataformas com base no tamanho do genoma, ploidia e nos seus objetivos de investigação.
Fluxo de Trabalho do Serviço de Sequenciação de Genoma De Novo: Desde a Amostra até a Montagem em Escala de Cromossoma
Controlo de Qualidade de Amostras
- Avaliação de integridade através de PFGE ou Femto Pulse
- Verificações de pureza (razões OD, Qubit e remoção de contaminação de RNA)
Levantamento do Genoma (Illumina)
- Sequenciação de leitura curta (~100X cobertura)
- Análise de K-mer para tamanho do genoma, conteúdo de repetições, heterozigose
- Guias para estratégia de leitura longa e Hi-C a jusante
Sequenciação de Longo Alcance (PacBio HiFi ou Oxford Nanopore)
- Montagem de novo de alta contiguidade de contigs primários
- Plataformas selecionadas com base nas propriedades do genoma alvo
- Cobertura de 30–100X dependendo da plataforma.
Estrutura de Apoio e Ancoragem de Cromossomas (Sequenciação Hi-C)
- Captura interacções de cromatina a longa distância
- Âncoras contigs a pseudo-cromossomas
- Permite a montagem do genoma em escala de cromossoma
Polimento e Correção de Erros
- Polimento de leituras curtas para correção de SNPs/indels
- Preenchimento de lacunas e resolução de repetições
- BUSCO e verificações de qualidade baseadas em alinhamento
Anotação Genómica (Adicional Opcional)
- Predição da estrutura do gene (ab initio e baseada em evidências)
- Mascaramento de região repetida
- Anotação funcional (GO, KEGG, Pfam)
Análise Bioinformática
O nosso pipeline de bioinformática genómica integra montagem de alto rendimento, anotação e análise comparativa—personalizado para espécies vegetais e animais. Quer esteja a trabalhar com um genoma diploide, poliploide ou altamente repetitivo, fornecemos soluções escaláveis e precisas para decifrar a complexidade.
Fluxo de trabalho
Requisitos de Amostra e Padrões de Qualidade
| Tipo de Amostra | Montante Requerido | Critérios de Pureza | Notas Especiais |
|---|---|---|---|
| Tecido animal fresco ou congelado | ≥ 1,5 μg gDNA (≥50 kb de comprimento médio) | OD260/280: 1,8–2,0; OD260/230: ≥2,0 | Evite amostras contaminadas com sangue; não realizar ciclos de congelamento-descongelamento. |
| Folhas ou caules de plantas | ≥ 2 μg gDNA (≥50 kb de comprimento médio) | O mesmo que acima | Evite a contaminação por polissacarídeos e polifenóis; prefira tecidos jovens e tenros. |
| Células cultivadas (por exemplo, peixes, insetos) | ≥ 1,5 μg gDNA | O mesmo que acima | Para insetos, remova o exoesqueleto de quitina antes da extração. |
| tecido entrecruzado Hi-C | ≥ 1 g de tecido fresco ou ~5 milhões de células | OD não aplicável (entrelaçado) | A ligação cruzada e a fixação devem seguir o nosso protocolo de preparação Hi-C. |
Critérios Gerais de QC:
- DNA de alto peso molecular: >50 kb preferido para plataformas de leitura longa (PacBio HiFi, Oxford Nanopore)
- Sem contaminação de RNA, proteína ou metabolitos secundários.
- Concentração: ≥50 ng/μL (Qubit); Integridade: Confirmada por gel de campo pulsado ou Femto Pulse
Precisa de ajuda com a extração de DNA?
A CD Genomics oferece serviços de extração de ponta a ponta, adaptados a genomas de plantas e animais, utilizando purificação por beads magnéticos para minimizar a fragmentação e contaminantes. Contacte-nos para saber mais.
Entregáveis
A CD Genomics oferece entregas abrangentes e bem organizadas para cada projeto de sequenciação de genoma completo de plantas ou animais de novo. Os nossos pacotes de dados são adaptados para uma análise subsequente sem interrupções e prontidão para publicação.
✅ Entregas Padrão
| Tipo de Ficheiro / Conteúdo | Descrição |
|---|---|
| Dados de Sequenciamento Brutos | Ficheiros FASTQ da PacBio HiFi, Nanopore, Illumina e/ou plataformas Hi-C |
| Resultados da Assembleia | Contigs e andaimes do genoma em formato FASTA |
| Relatório de Métricas de Montagem | Resumo do tamanho do genoma, N50, conteúdo de GC, completude (BUSCO, etc.) |
| Anotação do Genoma (Opcional) | Ficheiros GFF3/GTF, tabelas de anotação funcional, visualização da estrutura genética |
| Mapa de Interacção Hi-C | Matrizes de contacto e gráficos de montagem de andaimes (se Hi-C estiver incluído) |
| Gráficos de Circos e Synteny | Sumários visuais da arquitetura do genoma e análise comparativa |
| Relatório Resumido de Bioinformática | Métodos detalhados, versões de software e descrições de pipeline. |
✅ Add-ons Opcionais (Atualizações do Projeto)
Para projetos que requerem análise de dados avançada ou resultados personalizados, a CD Genomics oferece as seguintes opções de atualização:
| Opção de Atualização | Descrição |
|---|---|
| Montagem a Nível de Cromossoma | Atingido através de scaffolding Hi-C ou BioNano, fornecendo pseudomoléculas em escala de cromossoma. |
| Anotação do Genoma Funcional | Inclui previsão de genes, enriquecimento GO/KEGG, elementos repetidos e anotações de TE. |
| Pacote de Genómica Comparativa | Inclui sintenia de genoma completo, agrupamento de ortólogos e estimativa de distância evolutiva. |
| Construção do Pan-genoma | Integração de montagem de múltiplas amostras, deteção de variantes estruturais e conjuntos de genes partilhados/únicos |
| Integração do Epigenoma | Complemento para mapas de metilação ou modificação de histonas (requer preparação de amostra compatível) |
| Formatação de Dados Prontos para GWAS | Inclui chamada de SNP/INDEL, formatação VCF e ficheiros de estrutura populacional para pipelines de GWAS. |
Instantâneo do Projeto em Destaque
| Tipo de Espécie | Tamanho do Genoma | Contagem de Contigs | Contig N50 | Taxa de Ancoragem Hi-C |
|---|---|---|---|---|
| Planta A | 1,02 Gb | 626 | 7,15 Mb | 95,4% |
| Planta B | 793,46 Mb | 347 | 34,19 Mb | 96,1% |
| Animal Aquático A | 979,98 Mb | 513 | 5,36 Mb | 97,89% |
| Animal Aquático B | 827,62 Mb | 170 | 9,88 Mb | 99,51% |
| Mamífero | 3,3 Gb | 2.658 | 79,41 Mb | 98,58% |
| Inseto | 979,98 Mb | 513 | 5,37 Mb | 97,89% |
Estes genomas de alta contiguidade demonstram o robusto pipeline de montagem da CD Genomics em diversas espécies — desde genomas de plantas complexas até montagens a nível de cromossoma em mamíferos e organismos aquáticos.
Resultados da Demonstração
Os resultados parciais estão mostrados abaixo:
Distribuição da qualidade da base.
Distribuição de conteúdo base.
Número de SNP partilhado entre amostras.
Distribuição dos tipos de mutação SNP.
Estatísticas de gráfico de setores das anotações SNP.
Número de InDels partilhados entre amostras.
Distribuição do comprimento de InDel tanto a nível do genoma completo como nas regiões de CDS.
Estatísticas de gráfico de setores das anotações InDel.
Perguntas Frequentes sobre Sequenciação de Genoma Completo de Plantas/Animais de Novo
O que é o Sequenciamento de Genoma Completo de Novo de Plantas ou Animais?
É uma abordagem sem referência para reconstruir o genoma completo de uma espécie a partir do zero. Este método é essencial para espécies que não possuem um genoma de referência fiável ou aquelas com variações estruturais complexas.
Quando devo escolher o sequenciamento de genoma de novo em vez de re-sequenciamento?
Resposta:
Escolha sequenciação de novo quando:
- Não existe um genoma de referência de alta qualidade.
- A sua espécie possui uma diversidade ou complexidade genómica significativa.
- O seu objetivo é construir um pan-genoma ou melhorar a qualidade da referência atual.
Quais plataformas de sequenciação são utilizadas no seu serviço?
Utilizamos uma estratégia híbrida que combina:
- Illumina (para inquérito baseado em k-mer e polimento)
- PacBio HiFi / Oxford Nanopore (para geração de contigs de leitura longa)
- Hi-C (para a construção de andaimes a nível de cromossoma)
Esta abordagem em camadas maximiza a continuidade e a precisão da montagem.
Qualidade da amostra é necessária?
Os requisitos típicos incluem:
- gDNA de alto peso molecular
- OD260/280 = 1,8–2,0
- OD260/230 ≥ 2,0
- ≥10–15 μg de DNA total, dependendo da plataforma
Fornecemos diretrizes de submissão detalhadas mediante solicitação.
Quais serão os entregáveis que receberei?
Os entregáveis incluem:
- Genoma montado de alta qualidade (FASTA)
- Relatório de métricas de montagem e qualidade
- Ficheiros de predição de genes e anotação funcional
- Sumários visuais (por exemplo, mapas circulares do genoma, gráficos de sintecnia)
Você oferece análise de downstream?
Sim. A CD Genomics oferece opções avançadas de bioinformática, incluindo:
- Agrupamento de ortólogos
- Reconstrução filogenética
- Análise da expansão de famílias de genes
- Avaliação de sintenia e colinearidade genómica
Estudos de Caso de Sequenciação de Genoma Completo de Novo de Plantas/Animais
Destaque de Publicação do Cliente
Estudo de Caso: Decifrar os Mecanismos de Metilação m6A em Arabidopsis Usando Sequenciação de Novo de Todo o Genoma
Diário: Novo Fitologista
Fator de Impacto8.3
Publicado: 2017
DOI: 10.1111/nph.14586
Fundo
Como organismo modelo para a genética das plantas, Arabidopsis thaliana tem sido fundamental na descoberta de mecanismos regulatórios epigenéticos. Entre estes, N6-metiladenosina (m6A) A modificação do mRNA desempenha um papel fundamental no crescimento, desenvolvimento e respostas ao stress das plantas. No entanto, os componentes moleculares que impulsionam esta modificação — e a sua conservação funcional em plantas superiores — continuam a ser incompletamente compreendidos.
Este estudo teve como objetivo identificar os fatores genéticos essenciais para metilação de RNA m6A em Arabidopsis por integrar sequenciação de genoma completo de novo com genómica funcional direcionadaUm foco central foi colocado na compreensão do papel do HAKAI, um conservado ligase E3 de ubiquitina, dentro da maquinaria de metilação.
Materiais e Métodos
Análise do Genoma e Triagem de Mutantes:
- Mutantes de Arabidopsis thaliana com defeitos suspeitos de metilação m6A foram selecionados a partir de bibliotecas de inserção de T-DNA.
- O DNA genómico foi extraído e sequenciado de novo utilizando plataformas de leitura curta da Illumina e de leitura longa da ONT, alcançando alta contiguidade e cobertura.
- Os eventos de interrupção genética foram mapeados e validados.
Perfilagem de m6A:
- O RNA total foi isolado de linhas mutantes e selvagens.
- A quantificação de m6A foi realizada utilizando LC-MS/MS e m6A-seq baseado em imunoprecipitação.
Validação Funcional:
- Ensaios de complementação foram utilizados para verificar a função do gene.
- A RNA-seq foi aplicada para avaliar as consequências transcriptómicas da perda de HAKAI.
Resultados
O sequenciamento de genoma completo de novo permitiu a identificação precisa de inserções de T-DNA que disruptam HAKAI, um gene que codifica uma ligase E3 de ubiquitina do domínio RING. A perda funcional de HAKAI reduziu significativamente os níveis globais de metilação m6A, comparável a mutantes de escritores m6A conhecidos como por exemplo MTA e FIP37.
Principais Conclusões:
- A perda de HAKAI levou a defeitos na dominância apical, no tempo de floração e na viabilidade do embrião, fenocopiando outros mutantes de componentes centrais de m6A.
- A análise do transcriptoma revelou desregulação em vias de sinalização hormonal e de desenvolvimento chave.
- A complementação do gene HAKAI restaurou tanto os níveis de metilação m6A como o desenvolvimento normal.
Conclusão
Este estudo demonstrou que HAKAI é um componente crítico do complexo de metilação m6A. em plantas, atuando ao lado de metiltransferases canónicas. A utilização de sequenciação de genoma completo de novo permitiu o mapeamento preciso de interrupções genéticas e foi essencial para validar hipóteses funcionais em contextos geneticamente complexos.
O caso destaca como sequenciação de genoma completo de plantas de novo, emparelhado com ferramentas epitranscriptómicas e transcriptómicas, pode desvendar mecanismos regulatórios conservados. A CD Genomics apoia estudos semelhantes ao oferecer soluções integradas. montagem do genoma, análise de metilação, e genómica funcional pipelines para epigenética de plantas e além.
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