Diretrizes para Submissão de Amostras
Introdução – O que é QTL-seq?
QTL-seq é um método de sequenciação de nova geração baseado na análise de segregantes agrupados (BSA). Identifica rapidamente regiões genómicas, conhecidas como loci de traços quantitativos (QTLs), que estão associadas a características agrícolas ou biológicas importantes. Ao contrário do mapeamento de ligação tradicional, que requer anos de genotipagem de marcadores individuais, o QTL-seq utiliza sequenciação agrupada de fenótipos extremos para acelerar a descoberta.
Num típico abordagem QTL-seq, os investigadores cruzam dois progenitores contrastantes, desenvolvem uma população de mapeamento e, em seguida, agrupam indivíduos que apresentam fenótipos extremos (por exemplo, linhas de arroz resistentes vs suscetíveis a doenças). Sequenciar esses agrupamentos e comparar as diferenças de frequência alélica em todo o genoma permite a deteção de QTLs candidatos associados ao traço de interesse.
Esta abordagem tornou-se amplamente adotada na melhoria de plantas e na genómica funcional porque combina rapidez, custo-efetividade e mapeamento de alta resolução. Ao focar diretamente na variação do DNA entre os grupos, o QTL-seq permite que os investigadores localizem genes associados a características-chave em semanas, em vez de anos.
Por que escolher a abordagem QTL-seq?
VelocidadeIdentifique QTLs em semanas em vez de anos, sequenciando amostras em vez de populações inteiras.
Custo-efetividadeA agregação reduz o número de extrações de DNA e bibliotecas de sequenciação, diminuindo os custos experimentais.
ResoluçãoDados de sequência de alta densidade detetam regiões associadas a traços com maior precisão do que métodos convencionais.
FlexibilidadeAplicável a uma ampla gama de populações, incluindo F2, linhas recombinantes endogâmicas (RILs) e haploides duplicados (DH).
Uso entre espéciesValidação em arroz, milho, trigo, colza e muitas outras culturas.
O QTL-seq é particularmente valioso quando os investigadores precisam localizar genes de efeito maior que controlam características agronómicas, como resistência a doenças, altura da planta, rendimento ou tolerância ao stress. Ao encurtar o caminho desde o desenvolvimento da população até a descoberta de genes candidatos, permite uma tomada de decisão mais rápida na melhoramento de culturas e na genómica funcional.
Visão Geral do Pipeline QTL-seq
A CD Genomics oferece uma solução completa Pipeline de QTL-seq isso abrange cada passo desde o desenho do estudo até a descoberta de genes candidatos. O nosso fluxo de trabalho garante reprodutibilidade, eficiência de custos e resultados de alta qualidade adequados para publicação.
Passos do Fluxo de Trabalho QTL-seq
Seleção Parental e Design de População
- Escolha pais contrastantes (por exemplo, resistentes vs suscetíveis).
- Desenvolver populações de mapeamento apropriadas, como F2, RILs ou linhas DH.
Agrupamento de Fenótipos Extremos
- Selecione 20 a 50 indivíduos que apresentem os valores de traço mais altos e mais baixos.
- Agrupar o DNA de cada grupo para criar "Altos" e "Baixos".
Sequenciação
- Realize re-sequenciamento de alto rendimento utilizando plataformas Illumina, PacBio ou Nanopore.
- Alcançar uma profundidade suficiente para detectar variantes fiáveis.
Chamadas de Variantes
- Alinhar leituras ao genoma de referência.
- Detetar SNPs e Indels utilizando pipelines de bioinformática validados.
Cálculo do índice SNP e Δíndice SNP
- Calcule a frequência alélica (índice SNP) para cada bulk.
- Derivar o índice ΔSNP comparando os grupos para identificar regiões candidatas a traços.
Deteção de Regiões QTL Candidatas
- Visualizar o índice ΔSNP ao longo do genoma.
- Aplique limiares estatísticos e testes de permutação para confirmar a significância.
Anotação e Descoberta de Genes Candidatos
- Anotar variantes dentro de intervalos de QTL.
- Identificar mutações funcionais e realizar enriquecimento de vias GO/KEGG.
Resultados Chave
- Deteção rápida de QTLs associados a traços
- Gráficos de alta resolução para publicação
- Listas de genes candidatos anotados para validação posterior
Análise Bioinformática
Nosso bioinformática A equipa aplica pipelines validados para garantir resultados de QTL-seq precisos e reproduzíveis. Cada etapa da análise é realizada sob um rigoroso controlo de qualidade para fornecer resultados de alta confiança adequados para publicação e investigação posterior.
| Etapa de Análise | Descrição | Ferramentas / Métodos | Entregáveis |
|---|---|---|---|
| Controlo de Qualidade de Dados | Filtrar leituras de baixa qualidade, remover adaptadores, verificar o conteúdo de GC e duplicação. | FastQC, Trimmomatic | Ficheiros FASTQ limpos, relatório de QC |
| Alinhamento de Leitura | Mapear leituras limpas ao genoma de referência com alta precisão. | BWA-MEM, Bowtie2 | Ficheiros de alinhamento BAM |
| Chamadas de Variantes | Detetar SNPs e Indels em lotes agrupados. | GATK, SAMtools, FreeBayes | Arquivo VCF bruto com todas as variantes |
| Filtragem de Variantes | Aplique limiares de profundidade, qualidade e frequência para remover chamadas não confiáveis. | Filtragem rigorosa do GATK, scripts personalizados | VCF filtrado de alta qualidade |
| Cálculo do índice SNP | Estime a frequência alélica em cada bulk. | Scripts personalizados de QTL-seq, método de janela deslizante | Gráficos do índice SNP |
| Análise do Índice ΔSNP | Compare volumes, calcule o índice ΔSNP, realize testes estatísticos. | Pipeline QTL-seq, teste de permutação | Gráficos do índice ΔSNP, limiares de significância |
| Identificação de Regiões QTL | Definir regiões genómicas significativas associadas a características. | QTL IciMapping, scripts R personalizados | Intervalos QTL candidatos |
| Anotação Funcional | Anotar variantes dentro de intervalos de QTL, identificar genes candidatos. | ANNOVAR, Ensembl VEP | Lista de genes candidatos com anotações de variantes |
| Análise de Vias e Enriquecimento | Explorar funções biológicas de genes candidatos (GO/KEGG). | clusterProfiler, KEGG Mapper | Gráficos e tabelas de enriquecimento funcional |
Requisitos de Amostra
| Tipo de Amostra | Requisito | Notas |
|---|---|---|
| Linhas Parentais | Dois pais com fenótipos contrastantes (por exemplo, resistente vs suscetível). | Preferencialmente sequenciado; garante uma maior precisão na deteção de variantes. |
| Mapeamento da População | F2, RILs ou populações DH. | Tamanho da população: ≥200 indivíduos recomendado. |
| Construção em Lote | 20 a 50 indivíduos por grupo extremo. | Selecione com base nos valores de traço mais altos e mais baixos. Para QTG-seq: ≥1000. |
| Quantidade de DNA | ≥2 µg por volume. Concentração ≥50 ng/µL. | Forneça DNA suficiente para bibliotecas de resequenciamento. |
| Pureza do ADN | OD260/280 = 1,8–2,0; OD260/230 ≥2,0. | Livre de contaminação por RNA e inibidores. |
| Integridade do DNA | Banda clara de alto peso molecular em gel de agarose. | Sem degradação ou borrão visíveis. |
| Dados Fenotípicos (Opcional) | Medições de traços para todos os indivíduos mapeados. | Aumenta o poder estatístico para a deteção e validação de QTL. |
Entregáveis
Os clientes recebem um pacote de resultados abrangente, projetado para investigação e publicação subsequentes.
- Dados de sequenciação limpos (ficheiros FASTQ com relatório de QC)
- Ficheiros de variantes (VCF com SNPs e Indels)
- Gráficos do índice SNP e do Δíndice SNP
- Regiões QTL candidatas com estatísticas de significância
- Listas de genes candidatos anotados
- Resultados de enriquecimento GO/KEGG
- Relatório de análise pronto para publicação
Resultados da Demonstração
Gráfico do Índice SNP
Gráfico do Índice ΔSNP com Limiares
Enriquecimento Funcional de Genes Candidatos
Perguntas Frequentes sobre QTL-seq
Q: Qual é a diferença entre QTL-seq e mapeamento QTL tradicional?
A: O QTL-seq substitui grande parte da genotipagem individual por sequenciação em pool de fenótipos extremos, reduzindo drasticamente o custo e o esforço. Utiliza a frequência alélica (índice SNP e Δíndice SNP) através de bulks para a ligação de traços, em vez de escanear muitos marcadores individuais como na mapeação de ligação tradicional.
Q: Quantas amostras são necessárias para cada bulk em QTL-seq?
A: Precisa de pelo menos dezenas de indivíduos por bulk extremo (por exemplo, fenótipos altos vs baixos) para obter estimativas fiáveis de frequência alélica; mais indivíduos irão melhorar o poder estatístico. O tamanho do bulk depende da herdabilidade do traço, do tipo de população e da profundidade de sequenciação.
Q: Preciso sequenciar ambos os pais no QTL-seq?
A: Sim, sequenciar ambas as linhagens parentais melhora a precisão ao ajudar a filtrar a variação de fundo. Permite uma melhor identificação de marcadores polimórficos e um sinal ΔSNP-index mais claro.
Q: Que profundidade de sequenciação é necessária?
A: A profundidade deve ser suficiente para garantir estimativas fiáveis de frequência alélica—uma cobertura moderada a alta em amostras em grupo é essencial. Uma profundidade demasiado baixa aumentará o ruído e reduzirá a capacidade de identificar verdadeiras regiões QTL. (A profundidade exata depende do organismo e do tamanho do genoma.)
P: A QTL-seq pode ser utilizada para qualquer espécie de cultura?
A: Sim, o QTL-seq funciona para muitas culturas, incluindo arroz, trigo, milho, colza e outras—desde que haja um genoma de referência e polimorfismo suficiente entre os pais.
Q: Como é que a descoberta falsa ou a significância estatística é tratada no QTL-seq?
A: Limiares estatísticos (por exemplo, intervalos de confiança de 95% / 99%) e testes de permutação são utilizados. O suavização com janela deslizante do índice ΔSNP ajuda a reduzir o ruído. A filtragem de variantes de baixa qualidade e profundidades também é essencial.
Estudos de Caso de QTL-seq
CitaçãoReddappa, S.B., Aski, M.S., Mishra, G.P. et al. Mapeamento de QTL para características que contribuem para o rendimento em feijão-mungo (Vigna radiata L.) utilizando uma população RIL. Relatórios Científicos 15, 20795 (2025). Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei o prazer de ajudar com a tradução.
1. Contexto
Feijão-mungoVigna radiata L.) é uma cultura de pulso de curta duração importante para a segurança alimentar em toda a Ásia. Apesar do seu valor nutricional e do papel económico, a produtividade do feijão-mungo continua baixa devido a características de rendimento complexas influenciadas por múltiplos genes e pelo ambiente. Compreender a base genética das características relacionadas com o rendimento, como a altura da planta, o número de vagens, o peso das sementes e o rendimento de grãos, é crucial para a seleção assistida por marcadores e o melhoramento de variedades.
2. Métodos
- População: Uma população de linhas recombinantes endogâmicas (RIL) (166 linhas, F9:10) derivada de um cruzamento entre a variedade de alto rendimento Pusa Baisakhi e a linha de baixo rendimento PMR-1.
- Fenotipagem: Seis características que contribuem para o rendimento medidas ao longo de várias épocas (2022–2023).
- Genotipagem: A genotipagem por sequenciação (GBS) produziu 38.931 SNPs; 1.374 SNPs de alta qualidade foram utilizados para construir um mapa de ligação.
- Mapeamento de QTL: O mapeamento de intervalos compostos (CIM) e o mapeamento de múltiplos intervalos (MIM) foram aplicados para detectar QTLs significativos (LOD > 3.0). Genes candidatos foram identificados através do re-sequenciamento do genoma completo dos progenitores e da anotação funcional.
3. Resultados
Descoberta de QTLForam identificados 17 QTLs em nove cromossomas, explicando 9–24% da variância fenotípica.
QTLs chave:
- qPH-11-1: Altura da planta (21,5% PVE).
- qSW-10-1: Peso da semente (24,4% PVE).
- qGY-7-1: Rendimento de grãos (11% PVE).
Genes CandidatosIncluído LOC106777318 (inositol-tetrakisfosfato 1-quinase, PH), LOC106775680 (ferredoxina-like, SW), e LOC106768860 (fator de transcrição SPL, GY).
Ponto Quente do CromossomaO cromossoma 7 abriga cinco QTLs principais para múltiplas características, destacando a sua importância na melhoria do rendimento do feijão mungo.
Figura. Mapeamento de intervalos compostos de características relacionadas com o rendimento em feijão mungo, mostrando picos de pontuação LOD para altura da planta, SPAD, peso das sementes, número de vagens e rendimento de grãos.
4. Conclusões
Este estudo demonstra que o mapeamento de QTL baseado em SNP de alta densidade pode dissecá-lo efetivamente a arquitetura genética do rendimento em feijão mungo. O rendimento de grãos foi positivamente associado ao número de vagens, número de folhas e teor de clorofila. Dois QTLs com alta PVE (qPH-11-1 e qSW-10-1) são alvos principais para seleção assistida por marcadores. O cromossoma 7 emergiu como uma região chave que controla múltiplas características de rendimento, tornando-se um ponto quente para melhoramento. Os resultados fornecem marcadores moleculares e genes candidatos que podem acelerar os programas de melhoramento do feijão mungo.
Referências:
- Takagi H, Abe A, Yoshida K, Kosugi S, Natsume S, Mitsuoka C, Uemura A, Utsushi H, Tamiru M, Takuno S, Innan H, Cano LM, Kamoun S, Terauchi R. QTL-seq: mapeamento rápido de loci de características quantitativas em arroz através do re-sequenciamento do genoma completo de DNA de duas populações agrupadas.. Planta J. 2013 Abr;74(1):174-83. doi: 10.1111/tpj.12105. Epub 2013 Fev 18. PMID: 23289725.
- Reddappa, S.B., Aski, M.S., Mishra, G.P. et al. Mapeamento de QTL para características que contribuem para o rendimento em feijão mungo (Vigna radiata L.) utilizando uma população RIL.. Relatórios Científicos 15, 20795 (2025).
