Sequenciação de Células Únicas

A tecnologia GenSeqTM da CD Genomics fornece serviços abrangentes de sequenciação de células únicas. Estes padrões globais de expressão génica em células únicas já avançaram dramaticamente a biologia celular.

O que é Sequenciação de Célula Única

A sequenciação de células únicas representa um avanço significativo na nossa compreensão da heterogeneidade celular e dos processos biológicos. Esta tecnologia sofisticada facilita a análise de genomas, transcriptomas, epigenomas e proteomas com resolução a nível de célula única, proporcionando assim insights sem precedentes sobre as funções e interações celulares. Em contraste com a sequenciação convencional em massa, que produz dados médios de uma mistura de células, a sequenciação de células únicas revela as distintas assinaturas moleculares de células individuais, desvendando assim a complexidade intrincada e a diversidade presentes nos tecidos e organismos.

Por que realizar sequenciação de célula única

Tomando o transcriptoma como exemplo, o método tradicional de bulk Sequenciação de RNA (O RNA-seq em massa) envolve a extração e sequenciação do RNA misto de tecidos, órgãos ou grupos de células, resultando em dados transcriptómicos médios para essas populações celulares. Por exemplo, utilizando o RNA-seq em massa, pode-se identificar a expressão diferencial de genes entre tecidos tumorais e não tumorais adjacentes, observando variações em oncogenes e genes supressores de tumor. No entanto, dentro de um tumor, existem variações genéticas e transcriptómicas entre células localizadas no núcleo do tumor, periferia, metástases linfáticas e metástases distantes. Essas diferenças podem desempenhar papéis críticos na invasão de células cancerígenas, metástase e na evolução da resistência a medicamentos, influenciando subsequentemente a eficácia das intervenções terapêuticas.

Por outro lado, a sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) permite a análise da heterogeneidade tumoral ao nível de células individuais. Esta técnica facilita o estudo da evolução clonal e do desenvolvimento de células cancerígenas, da invasão precoce do câncer, das taxas e tipos de mutação nas células cancerígenas, do rastreio de metástases e disseminação, da caracterização do microambiente tumoral e da compreensão da evolução da resistência a fármacos durante o tratamento do câncer.

Metodologias para Sequenciação de Célula Única

As abordagens iniciais ao sequenciamento de células únicas envolviam a isolação de células individuais, seguida pela preparação de bibliotecas de baixo input e sequenciamento. Os métodos para isolar células únicas incluíam técnicas como diluição limitada, citometria de fluxo, microdissecação a laser e micromanipulação. Embora esses métodos sejam capazes de isolar células únicas, muitas vezes são complexos, demorados, dispendiosos e com baixo rendimento, o que limita a sua aplicação em larga escala.

Como Alcançar uma Captura de Células Únicas de Alto Rendimento

Estratégias contemporâneas utilizam principalmente a marcação de DNA para facilitar a identificação de células individuais. Cada célula é marcada com uma sequência de código de barras única, permitindo a construção de uma biblioteca agrupada e a subsequente diferenciação de ácidos nucleicos provenientes de células distintas com base no seu código de barras. Esta abordagem permite a análise simultânea de centenas a milhares de células únicas utilizando uma única preparação de biblioteca e corrida de sequenciação.

Aqui, discutimos duas técnicas proeminentes que utilizam este princípio para sequenciação de células únicas:

Sequenciação de Células Únicas Baseada em Microplacas:

O método subjacente envolve o controlo da concentração da suspensão celular para alocar células dissociadas em poços individuais de uma microplaca. Uma vez que as células se depositam no fundo, esferas magnéticas são adicionadas a cada poço. Estas esferas estão pré-carregadas com sequências Read1, códigos de barras, códigos de barras moleculares e sequências de captura. Em cada poço, células únicas sofrem lise, libertando os seus ácidos nucleicos, que são então capturados pelas esferas magnéticas. As esferas são posteriormente agrupadas para a construção da biblioteca e sequenciação. Métodos notáveis que utilizam esta técnica incluem BD Rhapsody e Singleron.

2. Sequenciação de Células Únicas Baseada em Microgotas:

Esta técnica começa com a dissociação do tecido para gerar uma suspensão de células individuais. Utilizando chips microfluídicos, as células e as esferas de captura são encapsuladas em gotículas, aproveitando a imiscibilidade das fases de óleo e água. As esferas de captura dentro destas gotículas estão equipadas com sequências Read1, códigos de barras, códigos de barras moleculares e sequências de captura. Dentro de cada gotícula, as células individuais são lisadas, os seus ácidos nucleicos são libertados e capturados pelas esferas. Estas esferas são então agrupadas para a preparação da biblioteca e subsequente sequenciação. Os métodos atuais que utilizam esta estratégia incluem Drop-seq, inDrop e 10× Genomics.

3. Soluções de Célula Única da 10× Genomics:

A 10× Genomics domina o mercado de células únicas, oferecendo uma variedade de produtos que facilitam a transcriptómica de células únicas (scRNA-seq), o perfilamento imunológico de células únicas (siRNA-seq), a acessibilidade da cromatina em células únicas (snATAC-seq), multi-ómi cas (snRNA+ATAC) e o perfilamento de proteínas de superfície (scCITE-seq) com resolução a nível de célula única.

Os Nossos Serviços de Sequenciação de Células Únicas

Utilizamos tecnologias avançadas de sequenciação de células únicas, como o 10x Genomics Chromium, para fornecer soluções abrangentes para o perfilamento de células individuais, análise da heterogeneidade tumoral e estudo de processos de desenvolvimento. A nossa equipa de especialistas garante resultados precisos e fiáveis através de um controlo de qualidade meticuloso.

• Sequenciação de RNA de Célula Única

  • A sequenciação de scRNA captura a expressão génica ao nível de células individuais, oferecendo uma imagem clara de como cada célula contribui para a função de um tecido. É especialmente valiosa para identificar tipos celulares raros e compreender as nuances do comportamento celular dentro de sistemas biológicos complexos.

• Sequenciação de DNA de Célula Única

  • Este método investiga a composição genética de células únicas, revelando variações e mutações específicas com alta precisão. Fornece informações cruciais sobre a diversidade genética dos tumores e ajuda a identificar anomalias genéticas associadas a várias doenças.

• Sequenciação de Metilação de DNA a Nível de Célula Única

  • Ao analisar padrões de metilação do DNA a nível de célula única, esta abordagem revela como as modificações epigenéticas influenciam a expressão génica e mantêm a identidade celular. É essencial para estudar o papel da epigenética no desenvolvimento e na doença.

• Sequenciação de Células Únicas 10x Genomics

  • Utilizando tecnologia microfluídica de ponta e codificação por barras, a 10x Genomics oferece dados abrangentes a nível de célula única. Esta plataforma destaca-se por fornecer informações detalhadas sobre paisagens transcriptómicas, genómicas e epigenómicas, melhorando a nossa compreensão da diversidade celular e das interações biológicas complexas.

Vantagens da Sequenciação de Células Únicas

• Fluxo de Trabalho AbrangenteUm processo completo, de ponta a ponta, concebido para a análise do transcriptoma completo de células individuais.
• Vazão MáximaFacilita o processamento paralelo de até 96 células individuais por corrida, uma escala sem precedentes.
• Amigável: Requer menos de três horas de tempo prático. O processamento direto a partir de células únicas é possível, sem necessidade de etapas de fragmentação e purificação de RNA.
• Custo-efetivo: Oferece uma redução de custos significativa, sendo um oitavo do preço de outros sistemas de preparação de bibliotecas atualmente disponíveis no mercado.
• Tecnologia de PontaUtilizamos as mais recentes plataformas de sequenciação de células únicas, incluindo 10x Genomics, garantindo resultados precisos e fiáveis.
• Apoio Especializado em BioinformáticaA nossa equipa de bioinformática fornece uma análise de dados robusta, oferecendo insights sobre a heterogeneidade celular, rastreio de linhagens e dinâmicas de expressão génica.
• Soluções PersonalizáveisOferecemos soluções personalizadas para atender aos requisitos específicos da sua pesquisa, desde o desenho experimental até a interpretação de dados.

Aplicações da Sequenciação de Célula Única

• Perfilando amostras clínicas escassas
• Medindo a heterogeneidade intra-tumoral e orientando a quimioterapia
• Análise da evolução das células cancerígenas durante a progressão do tumor
• Diagnóstico genético pré-implantação (DGP)
• Investigação da Diversidade das Células Imunes
• Desvendando a Biologia do Desenvolvimento
• Estudando Distúrbios Neurológicos
• Explorando Ecossistemas Microbianos

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Células Únicas

O advento da citometria de fluxo e da microdissecação a laser tornou possível capturar células únicas, e o DNA ou RNA de células únicas foi amplificado para sequenciação de célula única. O fluxo de trabalho geral para a sequenciação de célula única está descrito abaixo.

Requisitos de Amostra

Abaixo estão os requisitos de amostra para alguns dos nossos serviços de sequenciação de célula única. Para informações mais detalhadas, consulte as páginas de serviços específicas ou as Diretrizes de Submissão de Amostras. Além disso, se estiver interessado nos nossos serviços, entre em contacto connosco para confirmar os requisitos de amostra para sequenciação.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação de Células Únicas para a sua escrita (personalização)

A conferência de Sequenciamento de Células Únicas da CD Genomics explora as conexões entre a diversidade celular nos tecidos e a funcionalidade dos órgãos, lançando luz sobre as causas subjacentes de várias doenças. Para quaisquer pedidos ou perguntas adicionais, não hesite em entrar em contacto connosco.

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

1. O princípio, vantagens e desvantagens da amplificação do genoma de células únicas.

i. MDA (Amplificação por Deslocamento Múltiplo)

Inventado por Laskin et al. em 2001. Reagiu utilizando primers de polímero aleatórios de seis unidades e a polimerase de DNA φ29, que apresentava fortes propriedades de substituição de cadeia e podia amplificar o fragmento de DNA de 50~100kb em condições isotérmicas. Ao mesmo tempo, devido à sua atividade exonuclease 3'-5' e atividade de correção, a polimerase de DNA φ29 tem alta fidelidade. O método MDA tem uma cobertura genómica superior.

ii. MALBAC (Ciclos de Amplificação Baseados em Múltiplos Reaquecimentos e Laços)

O processo de amplificação quasilinear reduz a preferência de sequência da amplificação exponencial. Os primers amplificados de 5' contendo a sequência comum de 27bp e 3' é uma sequência aleatória de 8bp, que pode ser combinada com o molde a baixa temperatura entre 15 a 20 °C, e depois amplificar esses amplicons em forma de anel após a amplificação quasilinear de 8 a 12 ciclos.

A vantagem do método MALBAC é que a preferência de sequência é repetível entre diferentes células. Devido à sua melhor homogeneidade de amplificação, os seus dados são mais adequados para a análise de CNV. A fraqueza do MALBAC é que a fidelidade da polimerase que utiliza não é tão boa quanto a da polimerase de DNA φ29, portanto, o MALBAC terá mais falsos positivos ao detectar SNV; além disso, devido à sua preferência de sequência repetível, a região de baixa amplificação no genoma é às vezes perdida no processo de amplificação.

2. Requisitos de amostragem para sequenciação de células individuais.

Amplificação MDA: o volume da amostra não pode exceder 2 μL. O tubo de PCR fornecido pela empresa contém 2 μL de PBS. Amplificação MALBAC: o volume da amostra não pode exceder 1 μL. Assegure-se de que as amostras estão livres de Ca2+ e Mg2+, a empresa fornece um tubo contendo 4 μL de lisado. As amostras devem ser separadas de forma independente sempre que possível, evitando a adesão celular e fragmentos celulares, que podem afetar a qualidade da amplificação.

Análise de célula única da heterogeneidade celular e interacções na medula espinhal lesionada de rato

Revista: Jornal de Medicina Experimental

Fator de impacto: 12,6

Publicado: 16 de junho de 2021

Fundo

Na lesão da medula espinhal (LME), diversas células gliais e vasculares, juntamente com leucócitos infiltrantes, impulsionam o complexo processo de cicatrização. As etapas-chave incluem uma resposta imune inicial, um pico de proliferação glial e subsequente fibrose e gliose. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) oferece insights detalhados sobre os tipos celulares e suas interações, melhorando a nossa compreensão da LME e de outras lesões do SNC.

Materiais e Métodos

Resultados

Os autores realizaram sequenciação de RNA de célula única em amostras de lesão da medula espinhal (LME) para analisar a diversidade celular. Isto identificou 66.178 células e 15 tipos distintos, incluindo células imunes, vasculares e gliais. Assinaturas moleculares únicas e alterações genéticas dependentes da lesão foram observadas, oferecendo insights sobre respostas celulares específicas e potenciais biomarcadores.

Fig 1. Identificação transcriptómica dos principais tipos celulares que compõem o local de contusão da medula espinhal torácica média do rato em pontos temporais agudos.

A análise revelou 12 subtipos de células mieloides, incluindo quatro tipos de microglia e dois tipos de macrófagos, com alterações temporais significativas após lesão da medula espinhal (LME). A microglia passou de estados homeostáticos para inflamatórios, enquanto os macrófagos evoluíram de subtipos que induzem quimiotaxia para subtipos inflamatórios. Estas descobertas foram confirmadas tanto por imuno-histoquímica como por citometria de fluxo.

Fig 2. Identificação transcriptómica dos principais subtipos mieloides de forma aguda após a LES.

A análise revelou nove clusters macrogliais com alterações distintas após a lesão. As células astroepidémicas atingiram o pico em 1 dpi e depois diminuíram, enquanto as células da linhagem oligodendrocitária progrediram de OPCs para formas maduras. As OPCs e os astrócitos inicialmente respondem de forma semelhante, mas desenvolvem funções únicas até 7 dpi, com as OPCs também a desempenharem um papel na cicatriz glial.

Fig. 3. Perfil molecular e temporal da heterogeneidade macroglial agudamente após a lesão medular.

Conclusão

Este estudo utiliza transcriptómica de célula única para mapear tipos celulares e os seus papéis no local da lesão da medula espinhal. Revela fases distintas do comportamento das células mieloides, incluindo inflamação e migração, e identifica papéis-chave dos astrócitos e células de ponta na remodelação vascular. Apesar de algumas limitações na precisão da recuperação celular, os dados fornecem novas perspetivas sobre interações celulares e processos na lesão da medula espinhal.

Referência

1. Milich LM, Choi JS, Ryan C, et al. Análise de célula única da heterogeneidade celular e interacções na medula espinhal lesionada de rato. Revista de Medicina Experimental. 2021, 218(8):e20210040.