Diretrizes para Submissão de Amostras
Avaliar Cepas Microbianas Engenharia Antes de Avançar com Programas de P&D
Uma estirpe microbiana engenheirada pode passar por PCR, sequenciação Sanger ou confirmação baseada em marcadores e ainda deixar questões importantes sem resposta. Para as equipas de P&D da indústria farmacêutica e biotecnológica, a confirmação local é frequentemente apenas o primeiro ponto de verificação. Antes de uma estirpe avançar para a seleção de candidatos, desenvolvimento de processos, revisão por parceiros ou discussão interna sobre biossegurança, a equipa geralmente precisa de uma visão mais ampla a nível genómico.
Fornecemos avaliação de segurança de estirpes microbianas engenheiradas para ajudá-lo a entender se a estirpe corresponde ao seu design pretendido e se os sinais a nível genómico requerem uma revisão adicional. O nosso trabalho conecta sequenciação, bioinformática, verificações de QC e interpretação, para que a sua equipa receba mais do que uma pasta de dados.
Para projetos que necessitam de evidência de genoma completo, o nosso Sequenciação do Genoma Completo Microbiano o serviço pode ser integrado com análise, relatório e revisão de acompanhamento focados na segurança.
O que este serviço o ajuda a determinar
- A identidade da estirpe engenheirada é consistente com o organismo esperado?
- A modificação genética pretendida é detectável e interpretável?
- Existem alterações de sequência inesperadas perto da região engenheirada?
- Estão presentes genes de RAM, genes associados à virulência, genes relacionados com toxinas ou elementos móveis?
- Há evidências de retenção de plasmídeo, backbone do vetor ou sequência estrangeira?
- As estirpes candidatas múltiplas diferem em características genómicas relacionadas com o risco?
- Quais ficheiros de dados e tabelas de relatórios podem apoiar a revisão interna?
Este serviço não é um único teste de sequenciação. É uma avaliação baseada em projetos que liga dados de laboratório, análise do genoma, triagem focada na segurança e relatórios legíveis.
Quando as equipas farmacêuticas e de biotecnologia normalmente solicitam avaliação.
As equipas costumam entrar em contacto connosco quando uma estirpe engenheirada avançou além da construção inicial e agora necessita de provas mais robustas antes do próximo ponto de decisão.
- Seleção entre múltiplas estirpes candidatas engenheiradas
- Verificação da integridade da construção antes da ampliação ou desenvolvimento adicional.
- Revisão de sinais de AMR, virulência ou elementos móveis antes da discussão interna.
- Comparando uma estirpe engenheirada com a sua estirpe parental ou de referência.
- Apoio à revisão de biossegurança, revisão de colaboração ou diligência técnica.
- Preparar um pacote de dados para futura documentação ou discussões com parceiros.
Mantemos o serviço focado na geração e interpretação de evidências. Não exageramos no que os dados podem provar e não transformamos uma avaliação em fase de investigação numa reivindicação de aprovação.
O que Avaliamos: Precisão da Modificação, Identidade da Cepa e Sinais de Risco de Biossegurança
Cada estirpe microbiana engenheirada tem uma história técnica: o background parental, a estratégia de engenharia, o método de seleção, o design do vetor ou do doador, e o uso pretendido no programa de P&D. Começamos com esse contexto porque a avaliação de segurança correta depende de como a estirpe foi criada e do que a sua equipa precisa decidir a seguir.
Verificação de Modificação Genética
Avaliamos se a evidência genómica é consistente com a modificação pretendida. Dependendo do projeto, isso pode incluir a revisão de regiões de inserção ou deleção alvo, loci editados e contexto sequencial próximo, evidência da sequência do construto, alterações sequenciais inesperadas nas regiões engenheiradas, número de cópias ou arquitetura do construto, quando suportado pelos dados, e comparação com a estirpe parental ou de referência.
Para confirmação simples de alvos, a PCR ou o sequenciamento Sanger podem ser suficientes. Para uma revisão a nível genómico, o WGS oferece uma visão mais abrangente. Para plasmídeos, repetições, inserções complexas ou questões estruturais, o sequenciamento de leituras longas ou a montagem híbrida podem fornecer evidências mais úteis.
Triagem de RAM, Virulência, Toxina e Elementos Móveis
A triagem a nível genómico pode identificar sinais que devem ser revistos antes de uma estirpe avançar. Podemos triagem e relatar genes de resistência antimicrobiana, genes associados à virulência, genes relacionados com toxinas, elementos genéticos móveis, regiões associadas a profagos ou transposões, ilhas genómicas ou contexto de sequência relacionado com transferência, e anotações funcionais relevantes para a segurança.
Um registo de base de dados não é o mesmo que uma conclusão final sobre o risco. O nosso relatório separa o sinal detetado do seu contexto, incluindo a completude do gene, localização genómica, nível de similaridade, elementos vizinhos, background de estirpe esperado e se um seguimento direcionado pode ser útil.
Verificações de Plasmídeo, Backbone do Vetor e Sequência Estrangeira
Muitas estirpes engenheiradas são construídas utilizando plasmídeos, construções doadoras, marcadores selecionáveis ou sistemas baseados em vetores. Se estes elementos não se espera que permaneçam, a sua equipa pode precisar de provas de que estão ausentes ou não são suportados dentro do âmbito de deteção do método escolhido.
Dependendo da estratégia de sequenciação e das informações de design disponíveis, podemos rever as evidências da sequência do plasmídeo, as evidências da sequência da estrutura do vetor, as evidências da sequência de genes ou cassetes estrangeiros, as evidências de marcadores de seleção residuais, fragmentos do construto doador e o suporte a nível de contig ou a nível de leitura para elementos engenheirados.
Quando a arquitetura construtiva é complexa, o sequenciamento de genoma completo com leituras curtas pode não resolver todas as estruturas. Nesses casos, ajudamo-lo a decidir se deve ser adicionado sequenciamento de leituras longas ou montagem híbrida. Para projetos onde a estrutura, plasmídeos ou regiões repetitivas são questões centrais, Sequenciação de Genomas Microbianos Baseada em Nanoporos pode ser considerado como parte do design da avaliação.
Estabilidade Genética e Comparação de Estirpes Candidatas
Para estirpes que serão passadas, comparadas ou movidas para uma fase posterior de P&D, a estabilidade genética pode ser tão importante quanto a edição original. Podemos comparar estirpes, passagens, lotes ou versões candidatas para identificar alterações que possam afetar a interpretação.
Isto pode incluir a comparação de variantes em relação a uma estirpe parental ou de passagem anterior, a presença ou perda de elementos de sequência engenheirada, a retenção ou perda de plasmídeos quando aplicável, tabelas de comparação de estirpes candidatas, figuras resumidas focadas na estabilidade e recomendações de acompanhamento para validação direcionada.
O objetivo não é tornar cada projeto mais complicado. O objetivo é dar à sua equipa o nível certo de evidência para a decisão que têm à frente.
A Nossa Vantagem de Capacidade de Serviço para Projetos de P&D Farmacêutica
As equipas de farmacêutica e biotecnologia muitas vezes precisam de mais do que apenas ficheiros de sequenciação brutos. Pode ser necessário um parceiro de serviços que consiga compreender a estirpe engenheirada, selecionar uma estratégia de sequenciação adequada, realizar bioinformática focada na segurança e entregar resultados num formato que diferentes revisores internos possam utilizar.
Coordenação Integrada de Laboratório Úmido e Bioinformática
A nossa equipa coordena o sequenciamento e a análise em torno da mesma questão do projeto. A estratégia de sequenciamento não é selecionada de forma isolada. Está ligada ao fundo da estirpe, à modificação esperada, às condições da amostra e às necessidades de reporte.
- Se o objetivo é a triagem ampla, o sequenciamento genómico de leitura curta pode ser o ponto de partida prático.
- Se o objetivo é a reconstrução de plasmídeos, pode ser necessária a sequenciação de longas leituras.
- Se o objetivo é a comparação de candidatos, a manipulação consistente das amostras e as configurações de análise comparáveis são importantes.
- Se o objetivo é a revisão interna, o relatório deve explicar o que foi analisado e como os resultados devem ser interpretados.
Esta coordenação ajuda a fechar a lacuna entre os dados gerados e os dados utilizados.
Definição de Projeto por Contexto de Tensão e Estratégia de Engenharia
Antes de começarmos, pedimos as informações que nos ajudam a conceber uma avaliação útil: organismo e background da estirpe, informações sobre a estirpe parental ou de referência, método de engenharia, locus alvo ou mapa do construto, sequência esperada a ser inserida, deletada ou editada, informações sobre o vetor ou plasmídeo, informações sobre o marcador de seleção, estágio do projeto e uso interno pretendido do relatório.
Com este contexto, podemos recomendar um âmbito que se adeque ao projeto em vez de forçar todas as variantes a caber no mesmo pacote.
Relatório Pronto para Decisão para Revisão Interna
Diferentes membros da equipa leem o relatório de forma diferente. Um engenheiro de estirpes pode procurar evidências a nível de sequência. Um bioinformático pode verificar ficheiros, métodos e notas de base de dados. Um líder de projeto pode precisar de um resumo conciso. Um revisor de biossegurança pode querer saber o que foi analisado, o que foi detetado e o que necessita de acompanhamento.
- Resumo do projeto e amostra
- Resumo de QC de sequenciação
- Resumo da montagem ou mapeamento do genoma
- Revisão da modificação pretendida
- Tabela de triagem de AMR
- Tabela de triagem relacionada com a virulência e toxinas
- Resumo das evidências de elementos móveis e plasmídeos
- Métodos e notas de versão/base de dados
Mantemos a linguagem clara. Quando os dados suportam uma conclusão, mostramos as evidências. Quando os dados têm limitações, indicamos essas limitações.
Avaliação Flexível da Profundidade Sem Sobrecarregar o Estudo
Nem todos os projetos necessitam do fluxo de trabalho mais complexo. Algumas cepas precisam de uma avaliação focada de WGS. Outras precisam de sequenciação de long-read, montagem híbrida, testes de estabilidade genética ou comparação de candidatos.
- Subtestagem: riscos a nível genómico importantes podem ser negligenciados.
- Construção excessiva: o estudo torna-se mais complexo do que a decisão requer.
O resultado é um âmbito que se ajusta à sua estirpe, ao seu estágio de P&D e às suas necessidades de revisão.
Fluxo de Avaliação com Pontos de Verificação de QC
O nosso fluxo de trabalho segue o seu exemplo desde a receção do projeto até à entrega do relatório final. Cada etapa inclui tanto a análise técnica como os pontos de verificação do serviço que ajudam a manter o projeto interpretável.
Passo 1 — Receção do Projeto e Revisão do Contexto de Esforço: Começamos por rever o background da estirpe e o design de engenharia. Isto diz-nos o que deve estar presente, o que deve estar ausente e o que necessita de atenção especial durante a análise. Podemos solicitar o nome da estirpe e o background do organismo, informações sobre a estirpe parental ou de referência, estratégia de engenharia, locus alvo ou mapa do construto, alterações de sequência esperadas, mapa do vetor ou plasmídeo, informações sobre o marcador de seleção e o número de estirpes ou passagens a comparar. Ponto de controlo de QC: Verificamos se as informações do projeto submetido são suficientes para definir o âmbito de sequenciação e análise. Se faltar informação chave, sinalizamo-la antes de o projeto avançar.
Passo 2 — Seleção de Amostras de QC e Estratégia de Sequenciamento: Uma vez que as amostras entram no projeto, avaliamos se o material submetido é adequado para o fluxo de trabalho selecionado. O tipo e a qualidade da amostra afetam a montagem, o mapeamento, a revisão do plasmídeo e a interpretação subsequente. Para muitos projetos de estirpes engenheiradas, a sequenciação WGS de leituras curtas é um ponto de partida prático. A sequenciação de leituras longas pode ser recomendada quando o projeto necessita de uma resolução estrutural mais forte, reconstrução de plasmídeos ou revisão da arquitetura do inserto. A montagem híbrida pode ser útil quando tanto a precisão da sequência quanto o contexto estrutural são importantes. Ponto de controlo de QC: Analisamos a quantidade, pureza, integridade do DNA e a qualidade das leituras de sequenciamento antes de avançar para a análise completa. Se a amostra não se adequar ao fluxo de trabalho selecionado, podemos recomendar a reenvio ou uma estratégia revista.
Passo 3 — Montagem do Genoma, Anotação e Verificação de Alvos: Após a sequenciação, processamos os dados para análise a nível genómico. Dependendo do projeto, isso pode incluir QC de leituras, montagem, mapeamento, revisão de variantes, anotação genómica e revisão direcionada de regiões engenheiradas. Esta etapa ajuda a determinar se as evidências genómicas observadas são consistentes com o design da estirpe esperado. Ponto de controlo de QC: Revisamos a qualidade de montagem ou mapeamento, a consistência de cobertura, os indicadores de contaminação e se a região engenheirada é suportada pelo tipo de dados utilizado.
Passo 4 — Triagem de Risco e Interpretação Contextual: Em seguida, analisamos os dados genómicos em busca de sinais relevantes para a segurança. Isso pode incluir genes de resistência a antimicrobianos, genes associados à virulência, genes relacionados a toxinas, elementos móveis, regiões relacionadas a plasmídeos e evidências de sequências estrangeiras. O passo chave é a interpretação. Um resultado de similaridade de sequência precisa de contexto antes de ser útil. Revisamos se a correspondência é completa ou parcial, se está localizada em um elemento móvel ou cromossoma, se é esperada da estirpe parental e se uma validação adicional pode ser útil. Ponto de controlo de QC: Documentamos bases de dados, configurações de análise e notas de interpretação para que a sua equipa possa rever e reutilizar os resultados.
Passo 5 — Entrega do Relatório e Recomendações de Acompanhamento: O resultado final não é apenas uma pasta de dados. Entregamos um pacote de relatório estruturado que explica o que foi feito, o que foi detetado, o que não foi detetado dentro do âmbito da análise e quais os seguimentos que podem ser apropriados. Dependendo do projeto, também podemos fornecer tabelas de comparação de candidatos, resumos prontos para figuras e sugestões de validação direcionadas. Ponto de controlo de QC: Antes da entrega, revisamos a consistência entre as informações da amostra, métodos, tabelas de resultados e notas de interpretação.
Requisitos de Amostra para Avaliação de Cepas Microbianas Engenharia
Os requisitos de amostra dependem do tipo de organismo, tamanho do genoma, plataforma de sequenciação e profundidade de avaliação. Confirmamos os requisitos finais de submissão após rever o histórico da sua estirpe, a estratégia de engenharia e o fluxo de trabalho selecionado.
| Tipo de Amostra | Entrada Recomendada | Contentor | Envio | Pontos de Verificação de QC | Notas |
|---|---|---|---|---|---|
| DNA genómico | DNA genómico de alta qualidade; entrada final confirmada após revisão do projeto. | Tubo livre de nuclease | Packs frios ou gelo seco conforme aconselhado. | Concentração, pureza, integridade | Melhor para WGS quando o DNA purificado está disponível. |
| Cultura bacteriana ou de levedura | Cultura pura ou pellet; quantidade confirmada pelo tipo de estirpe. | Tubo ou placa estéril | Cadeia de frio conforme aconselhado | Pureza, viabilidade se aplicável, verificação de contaminação | Fornecer antecedentes da estirpe e condições de cultura. |
| Amostra microbiana inativada | Entrada confirmada pelo fluxo de trabalho e plano de extração. | Tubo estéril selado | Cadeia de frio conforme aconselhado | Recuperação de ADN, verificação de contaminação | Útil quando o envio de culturas vivas não é preferido. |
| DNA de plasmídeo ou vetor extraído | DNA plasmídico ou vetor purificado; entrada confirmada pelo âmbito do projeto. | Tubo livre de nucleases | Packs frios | Concentração, pureza | Útil para comparação de construções ou revisão de evidências vetoriais. |
| Dados de sequenciação existentes | FASTQ mais metadados disponíveis | Transferência de ficheiros segura | Upload digital | Qualidade de leitura, formato, completude de metadados | Útil para reanálise ou revisão de segunda opinião |
Antes da submissão da amostra, por favor forneça o background da estirpe, a modificação esperada, informações sobre a estirpe parental ou de referência, e qualquer mapa de vetor ou construção disponível. Isso ajuda-nos a escolher o caminho certo para sequenciação e análise. Para projetos relacionados à identidade, Sequenciação de Amplicões 16S/18S/ITS ou Sequenciação de Amplicões de 16S/18S/ITS de Comprimento Total pode também apoiar a identificação microbiana, dependendo da questão do projeto.
Análise e Entregáveis de Bioinformática
A bioinformática é central a este serviço. Para estirpes microbianas engenheiradas, a principal questão não é apenas qual sequência foi gerada, mas também o que a evidência a nível genómico significa para este projeto.
Entregas Mínimas
- Ficheiros de dados de sequenciação bruta
- Resumo de QC de sequenciação
- Resumo da montagem ou mapeamento do genoma
- Tabela de anotação do genoma
- Resumo da verificação da modificação pretendida
- Tabela de triagem de genes AMR
- Tabela de triagem de fatores de virulência
- Revisão do contexto de elementos móveis
- Resumo de evidências de plasmídeo, vetor ou sequência estrangeira
- Métodos e notas de versão/base de dados
- Relatório final em PDF com notas de interpretação
Estas entregas fornecem à sua equipa tanto as evidências subjacentes como o resumo legível necessário para a revisão.
Complementos Opcionais para Avaliação de Maior Resolução
- Sequenciação de leitura longa
- Montagem híbrida
- Revisão de variantes estruturais
- Reconstrução de plasmídeos
- Deteção de backbone vetorial
- Comparação da estabilidade genética entre passagens
- Matriz de comparação de estirpes candidatas
- Triagem de base de dados personalizada
- Genómica comparativa contra estirpes parentais ou de referência
- Lista de recomendações de validação direcionada
Recomendamos complementos apenas quando eles respondem a uma verdadeira questão do projeto. Por exemplo, a sequenciação de leitura longa pode ser útil quando a estrutura do plasmídeo ou a arquitetura do inserto são importantes, mas pode não ser necessária para um rastreio genómico simples.
Como são interpretados os AMR ou os impactos de virulência
Os resultados da base de dados de AMR e virulência necessitam de uma revisão cuidadosa. Um resultado pode representar um gene completo, uma correspondência parcial, uma característica de fundo da estirpe ou um sinal que necessita de validação adicional.
- Identidade e semelhança genética
- Completude do impacto
- Localização genómica
- Elementos móveis nas proximidades
- Se o impacto é esperado a partir do contexto parental.
- Se várias estirpes candidatas diferem
- Se a validação direcionada pode ser útil
Não transformamos acessos a bases de dados em afirmações não suportadas. Reportamos o que os dados mostram, explicamos o contexto e ajudamos a sua equipa a decidir o que rever a seguir.
Escolhendo a Estratégia de Avaliação Certa: PCR, WGS de Leitura Curta, Sequenciação de Leitura Longa ou Montagem Híbrida
Perguntas diferentes requerem métodos diferentes. Ajudamo-lo a selecionar a abordagem certa com base na cepa, na característica engenheirada e na decisão que a sua equipa precisa de tomar.
| Método | Melhor Usado Para | Forças | Limitações | Bom Ajuste para |
|---|---|---|---|---|
| PCR / Sanger | Confirmar uma região-alvo conhecida | Focado, útil para edições conhecidas, fácil de interpretar. | Não faz a triagem de todo o genoma; limitado para alterações inesperadas. | Confirmação precoce da construção |
| Sequenciação de Genoma de Leitura Curta | Triagem e anotação em todo o genoma | Cobertura ampla, prático para triagem de AMR/virulência, útil para revisão de SNV/indel. | Pode ter dificuldades com repetições, plasmídeos complexos e grandes arranjos estruturais. | Avaliação de deformação padrão engenheirada |
| Sequenciação de Leitura Longa | Plasmídeos, repetições, arquitetura de inserção, variantes estruturais | Melhor resolução estrutural e continuidade de contigs | Pode precisar de dados adicionais ou de um polimento dependendo das necessidades de precisão. | Construtos complexos ou estirpes com elevado conteúdo de plasmídeos |
| Montagem Híbrida | Combinação da precisão de leituras curtas e da estrutura de leituras longas | Maior confiança na montagem para muitos genomas microbianos | Design e análise de estudo mais complexos | Reconstrução do genoma com alta confiança |
| Teste de Estabilidade Genética | Comparando passagens, lotes ou versões de candidatos | Ajuda a acompanhar as mudanças ao longo do tempo ou entre candidatos. | Exige um design de comparação planeada | Desenvolvimento de processos ou priorização de candidatos |
| Genómica Comparativa Personalizada | Comparando estirpes engenheiradas com estirpes parentais/referência | Útil para seleção de estirpes e revisão interna | Requer boas referências ou dados parentais. | Programas de I&D com múltiplos candidatos |
Regras de Seleção por Fase do Projeto
- Use um PCR focado ou abordagem Sanger quando a única questão é se uma edição conhecida está presente.
- Utilize WGS de leitura curta quando a sua equipa precisar de uma visão genómica abrangente da identidade, anotação, genes de AMR, genes associados à virulência e sinais de sequência não intencionais.
- Adicione sequenciação de leitura longa quando a estrutura do plasmídeo, a arquitetura do inserto, regiões repetitivas ou variantes estruturais forem importantes.
- Utilize a montagem híbrida quando tanto a precisão a nível base como o contexto estrutural forem importantes.
- Adicione testes de estabilidade genética quando a estirpe for passada, escalada, comparada entre lotes ou utilizada como candidata para desenvolvimento adicional.
- Utilize a comparação de candidatos quando a sua equipa tiver várias estirpes engenheiradas e precisar de uma forma prática de escolher qual delas deve avançar.
Aplicações em P&D Farmacêutico, Biologia Sintética e Biomanufatura
A avaliação da segurança de estirpes microbianas engenheiradas pode apoiar vários tipos de programas de P&D. Mantemos a avaliação alinhada com a fase do projeto e a decisão interna que a sua equipa precisa de tomar.
Triagem de Cepas Candidatas
Quando várias estirpes engenheiradas estão disponíveis, a comparação a nível genómico pode ajudar a identificar diferenças que são relevantes para o desenvolvimento posterior. O relatório pode comparar edições pretendidas, sinais de RAM ou virulência, evidências de plasmídeos e alterações relacionadas com a estabilidade entre os candidatos.
Investigação em Probióticos e Terapias Microbianas Engenharia
As terapias microbianas e a investigação de probióticos engenheirados frequentemente requerem uma análise cuidadosa a nível de estirpe. A análise a nível do genoma pode apoiar discussões internas sobre a identidade da estirpe, conteúdo genético relevante para a segurança, evidências de construção e seleção de candidatos.
Revisão de Cepas de Biomanufatura e Fermentação
As estirpes de produção utilizadas na biomanufatura ou fermentação podem necessitar de revisão antes do desenvolvimento do processo ou avaliação de parceiros. Podemos avaliar características a nível genómico, evidências de plasmídeos ou vetores, e sinais de estabilidade que podem afetar a confiança técnica.
Colaboração, Transferência de Tecnologia e Apoio à Revisão Interna
Quando uma estirpe é partilhada com parceiros ou revista por equipas internas, um pacote de avaliação claro pode reduzir a ambiguidade. Ajudamos a organizar os resultados num formato que pode ser lido por engenheiros de estirpes, bioinformáticos, líderes de projeto e revisores de biossegurança.
Para projetos que envolvem fundos microbianos complexos ou amostras mistas, Sequenciação Metagenómica pode ser relevante como uma abordagem de projeto separada. Para questões especializadas envolvendo heterogeneidade microbiana ou análise de ligação ao hospedeiro, Sequenciação de Células Únicas Microbianas pode também ser considerado.
Referências
- Avaliação de Presunção de Segurança Qualificada da EFSA
- Declaração da EFSA sobre os requisitos para a análise de sequências do genoma completo de microrganismos utilizados intencionalmente na cadeia alimentar.
- Avaliação do sequenciamento multiplex por nanoporo para a previsão de serótipos de Salmonella e deteção de genes de resistência a antimicrobianos e genes de virulência.
- Avaliação das diretrizes existentes quanto à sua adequação para a avaliação de risco alimentar e de ração de microrganismos obtidos através da biologia sintética.
- Avaliação de segurança de alimentos derivados de microrganismos geneticamente modificados
Resultados da Demonstração: O Que o Seu Relatório de Avaliação Pode Incluir
Resumo da Verificação de Modificação a Nível Genómico
Esta vista de relatório resume se as evidências de sequenciamento suportam a região projetada ou o design do constructo esperado. Pode incluir uma visão geral da região-alvo, descrição da sequência ou edição esperada, resumo do suporte de leitura ou contig, comparação com a sequência parental ou de referência, e notas sobre regiões que podem precisar de validação por long-read ou direcionada. Um painel de verificação de constructos pode facilitar para a sua equipa a revisão do design esperado, das evidências detetadas e de quaisquer regiões que necessitem de acompanhamento.
Matriz de Avaliação de Risco de AMR / Virulência / MGE
Esta vista do relatório organiza os resultados de triagem por categoria. Ajuda a sua equipa a ver rapidamente se foram detetados genes de RAM, genes associados à virulência, genes relacionados com toxinas ou sinais de elementos móveis e como devem ser analisados. Uma matriz ou mapa de calor pode ajudar a separar os sinais detetados das notas de interpretação, para que os revisores possam ver tanto o resultado da triagem como o seu contexto.
Visualização de Evidências de Plasmídeo, Vetor e Sequência Estrangeira
Para estirpes engenheiradas construídas com plasmídeos, vetores, construções doadoras ou marcadores de seleção, esta visualização de relatório resume se há evidência de sequência relevante presente. Pode incluir evidência de backbone de vetor, contigs relacionados a plasmídeos, evidência de cassete de gene estrangeiro, evidência de sequência de marcador, suporte a nível de alinhamento ou contig, e notas sobre se a resolução estrutural é suficiente.
FAQ: Planeamento de uma Avaliação de Segurança de Cepas Microbianas Engenharia
1. O WGS por si só é suficiente para a avaliação da segurança de estirpes microbianas engenheiradas?
O WGS é frequentemente o método principal, mas pode não responder a todas as questões. O WGS de leitura curta é útil para triagem genómica em larga escala, anotação, revisão de genes de resistência a antimicrobianos (AMR) e virulência, e muitos tipos de análise de variantes. Se o projeto envolver plasmídeos, repetições, inserções complexas ou alterações estruturais, o sequenciamento de leitura longa ou a montagem híbrida podem ser uma melhor opção.
2. Quando deve ser adicionada a sequenciação de leitura longa?
Adicione sequenciação de leitura longa quando a estrutura é importante. Muitas vezes, consideramos isso para reconstrução de plasmídeos, revisão de backbone de vetores, análise da arquitetura de inserções, resolução de regiões repetitivas ou revisão de variantes estruturais. Não é sempre necessário, mas pode adicionar um contexto importante para estirpes engenheiradas complexas.
3. Que tipos de evidência de RAM e virulência podem ser reportados?
O relatório pode incluir triagem de genes de AMR, triagem de genes associados à virulência, revisão de genes relacionados a toxinas, contexto de elementos móveis, informações de correspondência de bases de dados e notas de interpretação. Também documentamos informações sobre a base de dados e a versão, quando aplicável, para que a sua equipa possa rever como os resultados foram gerados.
4. Consegue verificar os resíduos do plasmídeo, do backbone do vetor ou da sequência estrangeira?
Sim, quando o projeto inclui a informação de referência correta e a estratégia de sequenciação. Podemos solicitar mapas de vetores, sequências de construção, informações sobre o inserto esperado e dados da linhagem parental. Para estruturas complexas, pode ser recomendada a sequenciação de leituras longas ou a montagem híbrida.
5. Podem ser comparadas várias estirpes engenheiradas lado a lado?
Sim. A comparação de estirpes candidatas pode ajudar a identificar diferenças nas regiões engenheiradas, sinais de RAM ou virulência, evidências de plasmídeos, anotação do genoma e alterações relacionadas à estabilidade. Isso é útil quando a sua equipa precisa decidir qual estirpe deve avançar.
6. Que informações de amostra devemos fornecer antes da definição do projeto?
Por favor, forneça o nome do organismo, informações sobre a linhagem de fundo, informações sobre a linhagem parental ou de referência, estratégia de engenharia, alterações de sequência esperadas, mapa do vetor ou do constructo, informações sobre o marcador de seleção e o número de amostras ou candidatos a comparar.
7. Como são interpretados os acessos à base de dados no relatório final?
Reportamos o resultado e o seu contexto. Isto pode incluir a identidade do gene, nível de correspondência, completude, localização genómica, elementos móveis nas proximidades e se o resultado é esperado com base no fundo da estirpe. Não tratamos todos os resultados com o mesmo nível de preocupação.
8. O relatório pode apoiar a revisão interna de biossegurança ou de P&D?
Sim. O relatório foi concebido para ajudar as equipas internas a reverem as evidências a nível genómico, métodos, resultados de controlo de qualidade, sinais detetados e notas de interpretação. Pode apoiar a tomada de decisões internas, a comparação de candidatos e o planeamento de projetos.
Exemplo de Caso Apoiado pela Literatura: Detecção de Genes de Resistência Antimicrobiana e Virulência Baseada em WGS
Destaque de Pesquisa Publicada
Avaliação da sequenciação multiplex por nanoporo para a previsão de serótipos de Salmonella e deteção de genes de resistência a antimicrobianos e genes de virulência.
Diário: Fronteiras em Microbiologia
Publicado: 2023
Fonte: Wu et al., Fronteiras na Microbiologia 2023
Fundo
Um desafio comum na avaliação de estirpes microbianas é que as características relevantes para a segurança nem sempre são visíveis a partir da confirmação direcionada. Os genes de resistência a antimicrobianos, os genes associados à virulência, os marcadores de serotipo e as características genómicas relacionadas frequentemente requerem sequenciação genómica abrangente e interpretação suportada por bases de dados.
Wu e colegas avaliaram o sequenciamento multiplex Oxford Nanopore para previsão de serótipos de Salmonella e deteção de genes de resistência a antimicrobianos e virulência. A Salmonella não é utilizada aqui como um exemplo de estirpe de produção engenheirada. O valor deste artigo para a nossa página é o seu fluxo de trabalho: mostra como os dados de WGS podem ser organizados para a deteção de características bacterianas e comparados com dados de sequenciamento estabelecidos.
Métodos
Os autores testaram um fluxo de trabalho de WGS multiplex baseado em ONT utilizando 69 sorótipos representativos de Salmonella. Compararam os resultados baseados em ONT com dados de sequenciação Illumina e informações de sorotipagem existentes.
O fluxo de trabalho mostrado em Figura 1 cobre cultura bacteriana, extração de DNA, preparação de bibliotecas, sequenciação multiplex, chamada de bases, desmultiplexação, montagem ou análise, previsão de serotipo e deteção de genes de RAM/virulência. A figura pode ser verificada em Wu et al., Fronteiras em Microbiologia 2023.
Resultados
O estudo avaliou 69 serótipos de Salmonella e relatou uma previsão de serótipo in silico precisa com dados de nanopore-WGS em cerca de cinco horas após o sequenciamento, com um mínimo de 30× de cobertura do genoma de Salmonella utilizando o SeqSero2. Usando dados da Illumina como referência, os autores relataram um valor médio de precisão de 0,99 por isolado tanto para a deteção de genes de resistência a antimicrobianos (AMR) como para a deteção de genes de virulência.
Os autores também notaram pequenas variações entre os perfis de genes de AMR/virulência das plataformas de sequenciação Illumina e Nanopore. Este detalhe é importante porque demonstra por que a profundidade de sequenciação, as configurações de análise e o contexto do método devem ser revistos antes que os resultados sejam utilizados nas decisões do projeto.
Para a avaliação de estirpes microbianas engenheiradas, a lição mais relevante é a estrutura da evidência. O WGS pode apoiar a deteção de características quando a qualidade do sequenciamento, o fluxo de trabalho de análise, a triagem de bases de dados e a interpretação estão interligados. Essa é a mesma lógica que aplicamos ao rever evidências de RAM, virulência, elementos móveis, plasmídeos ou sequências estrangeiras em projetos de estirpes engenheiradas.
A Figura 1 do estudo publicado resume um fluxo de trabalho multiplex ONT-WGS para a previsão de serótipos bacterianos e deteção de genes de AMR/virulência.
Conclusão
Este exemplo publicado apoia o uso de WGS como um método prático para a deteção de características bacterianas, incluindo a triagem de genes de RAM e virulência. Para a avaliação de estirpes microbianas engenheiradas, os dados a nível genómico tornam-se mais úteis quando são acompanhados de uma revisão de QC, triagem em bases de dados e interpretação clara.
Não usaríamos este artigo para afirmar que todas as estirpes engenheiradas podem ser avaliadas da mesma forma. Em vez disso, ele apoia a justificação científica mais ampla para a triagem de genes de risco baseada em WGS e a organização de evidências.
Referência
Este serviço destina-se apenas a Uso em Pesquisa (RUO). Não se destina ao diagnóstico clínico, seleção de tratamento ou decisões de gestão direta do paciente.
