Diretrizes para Submissão de Amostras
O que é 10x Visium Fresh Frozen Spatial Transcriptomics?
A plataforma de Expressão Génica Espacial Visium da 10x Genomics mapeia a atividade génica em seções de tecido intactas, capturando e sequenciando mRNA com cauda poli(A) diretamente de pontos com código de barras espaciais numa lâmina de vidro. O fluxo de trabalho Fresh Frozen (FF) utiliza o método de colocação direta: uma fatia de tecido crioselecionada é montada diretamente na matriz de captura Visium, permitindo a perfuração do transcriptoma completo sem os painéis de sondas pré-projetados necessários para os fluxos de trabalho FFPE — tornando-o especialmente adequado para pesquisa em transcriptómica espacial em qualquer espécie com um genoma de referência.
Cada lâmina de captura Visium contém quatro áreas de captura de 6,5 × 6,5 mm (ou duas áreas de 11 × 11 mm na lâmina de formato grande). Dentro de cada área, aproximadamente 5.000 pontos com código de barras — cada um com 55 µm de diâmetro e um espaçamento de 100 µm entre centros — capturam RNA com cauda poli(A) do tecido sobrejacente. Cada ponto recebe assim RNA de uma região contendo uma média de 1 a 10 células, dependendo do tamanho das células e da densidade do tecido. Após a permeabilização do tecido liberar RNA das células, a transcrição reversa in situ anexa cDNA aos códigos de barras espaciais na superfície da lâmina. O cDNA indexado espacialmente resultante é amplificado e convertido em bibliotecas compatíveis com Illumina.
A vantagem crítica do fluxo de trabalho de colocação direta FF sobre abordagens FFPE baseadas em sondas é a sua completa ausência de viés: cada transcrito poliadenilado no tecido é capturado proporcionalmente à sua abundância, sem seleção de alvo na fase de preparação da biblioteca. Isso torna o Visium FF a abordagem preferida para experimentos de descoberta — identificação de novos tipos celulares, mapeamento de domínios espaciais de novo e transcriptómica entre espécies — onde a cobertura do transcriptoma completo e imparcial é cientificamente essencial. Para uma comparação mais ampla de Tecnologias de RNA-seqconsulte os nossos recursos de sequenciação do transcriptoma.
Visium FF vs. Outras Abordagens de Transcriptómica Espacial
Compreender onde o Visium FF se destaca — e onde métodos complementares acrescentam valor — é essencial para o design experimental.
| Recurso | RNA-Seq em massa | scRNA-Seq | Visium FF (Este Serviço) | Visium FFPE / CytAssist |
|---|---|---|---|---|
| Resolução espacial | Nenhum | Nenhum (dissociado) | ~55 µm ponto (1–10 células) | ~55 µm ponto (baseado em sonda) |
| Cobertura do transcriptoma | Transcriptoma completo | Transcrição total do transcriptoma | Transcrição total do transcriptoma (poly(A)) | Painel definido (~18.000 genes humanos) |
| Compatibilidade entre espécies | Qualquer | Qualquer | Qualquer um com genoma de referência | Humano, rato (provas validadas) |
| Requisito de amostra | RNA em massa | Suspensão de células individuais | Bloco de tecido OCT congelado fresco | FFPE ou bloco congelado fixo |
| Arquitetura do tecido preservada | ✗ | ✗ (dissociação necessária) | ✓ — contexto espacial nativo | ✓ |
| Projeto de sonda necessário | Não | Não | Não — captura de poli(A) imparcial | Sim — conjunto de sondas específicas para espécies |
| Descoberta de transcritos novos | ✓ (sem espacial) | ✓ (sem espacial) | ✓ + coordenadas espaciais | ✗ — limitado pela sonda |
| Melhor caso de uso | Expressão em nível populacional | Deconvolução de tipos celulares | Descoberta, organismos não modelo, biologia espacial nova | Amostras clínicas arquivadas, painéis validados em humanos/morcegos |
Fluxo de Trabalho de Serviço
Do bloco de tecido congelado fresco à atlas de expressão espacial pronto para publicação — o nosso pipeline Visium FF cobre cada passo com protocolos validados e suporte especializado.
Passo 1 — QC de Tecidos e Criosecção: Os blocos de tecido embebidos em OCT, congelados e frescos, são avaliados quanto à integridade do tecido, qualidade morfológica e qualidade do RNA (avaliação do RIN a partir de fatias de tecido adjacentes). O tecido é cortado em criostato com uma espessura de 10 µm sob condições de temperatura controlada. As secções são colocadas diretamente no slide de captura Visium dentro da moldura de referência de cada área de captura — não é necessário o passo de transferência CytAssist para a colocação direta de FF.
Passo 2 — Coloração H&E e Imagem em Campo Brilhante: As secções montadas são fixadas, coradas com Hematoxilina e Eosina (H&E) e fotografadas em alta resolução (ampliação de 10× ou 20×) utilizando um microscópio de campo claro antes da captura de RNA. Esta imagem é utilizada posteriormente pelo Space Ranger para alinhar códigos de barras espaciais à morfologia do tecido, permitindo a sobreposição direta de clusters de expressão gênica na imagem histológica. A coloração por imunofluorescência (IF) está disponível como uma alternativa ao H&E para a co-detecção de proteínas.
Passo 3 — Permeabilização e Captura de mRNA Poli(A): A secção de tecido é permeabilizada com uma enzima específica para o tipo de tecido e tempo, libertando mRNA com cauda poli(A) das células. O RNA libertado difunde-se diretamente para os pontos de captura subjacentes, onde hibridiza com oligonucleotídeos de captura poli(dT) com código de barras espacial. A transcrição reversa in situ incorpora o código de barras espacial e os códigos de barras moleculares no cDNA de primeira cadeia ancorado à superfície do porta-objetos.
Passo 4 — Preparação da Biblioteca e Sequenciação Illumina: O cDNA indexado espacialmente é desnaturado do slide, amplificado e convertido numa biblioteca compatível com Illumina. As bibliotecas são sequenciadas no NovaSeq a uma profundidade recomendada de 25.000–50.000 leituras por ponto (aproximadamente 125–250 milhões de leituras por área de captura). A sequenciação de extremidade pareada 28+90 bp lê o código de barras espacial de 16 nt + os códigos de barras moleculares de 12 nt na Leitura 1 e o inserto de cDNA na Leitura 2.
Passo 5 — Processamento de Space Ranger e Bioinformática: Os ficheiros FASTQ brutos são processados através do pipeline Space Ranger da 10x para desmultiplexação de códigos de barras, alinhamento de leituras, contagem de códigos de barras moleculares e registo de códigos de barras espaciais na imagem H&E. A análise posterior utiliza Seurat ou Squidpy para agrupamento não supervisionado, deteção de genes espacialmente variáveis e deconvolução de tipos celulares. Os entregáveis completos estão descritos na seção de Bioinformática abaixo.
Principais Aplicações
O Visium FF é o método preferido quando a arquitetura tecidual espacial deve ser preservada juntamente com a descoberta do transcriptoma completo — particularmente em espécies não humanas, tecidos complexos e novos modelos de doenças.
Microambiente Tumoral e Biologia Espacial do Câncer
O Visium FF resolve a heterogeneidade transcricional dentro dos tumores a nível espacial — mapeando as diferenças na expressão génica entre o núcleo do tumor, a borda invasiva e o estroma circundante numa única experiência. As análises de interações entre ligandos e recetores revelam redes de sinalização paracrina entre as populações de células tumorais e imunes no seu contexto tecidual nativo, avançando na compreensão da resistência ao tratamento e da evasão imunitária.
Arquitetura do Cérebro e do Tecido Neural
A citoarquitetura em camadas do cérebro torna o contexto espacial essencial para a interpretação de dados de expressão genética. O Visium FF resolve padrões de expressão específicos de camadas corticais, transcriptomas de subcampos do hipocampo e organização laminar do cerebelo com cobertura de transcriptoma completo — apoiando a pesquisa em neurociência em tecido cerebral pós-morte de rato, camundongo, zebrafish e humano.
Biologia do Desenvolvimento e Atlas de Tecidos
O mapeamento da expressão gênica espacial durante o desenvolvimento embrionário e de órgãos revela gradientes de padrão, limites de sinalização e identidades de compartimentos teciduais que são invisíveis em dados de célula única de amostras dissociadas. O Visium FF é compatível com diversos estágios embrionários entre espécies — permitindo a construção de atlas espaciais para projetos de biologia do desenvolvimento e genómica comparativa.
Organismos Não Modelo e Estudos Entre Espécies
Ao contrário do Visium baseado em sondas FFPE, que requer painéis de sondas específicos para espécies validados apenas para humanos e ratos, a captura polia (poly(A)) não enviesada do Visium FF funciona para qualquer organismo com um genoma de referência — tornando-o o único modo Visium adequado para peixes-zebra, animais de agricultura, insetos e organismos de pesquisa não modelo. Para sequenciação do transcriptoma espacial em espécies não padrão, o Visium FF é o ponto de partida recomendado.
Integração Espacial de Multi-Ómicas com scRNA-Seq
Os dados do Visium FF são rotineiramente integrados com sequenciação de RNA de célula única conjuntos de dados utilizando ferramentas de deconvolução computacional (SPOTlight, RCTD, cell2location) para alcançar um mapeamento espacial com resolução a nível de célula. Cada ponto Visium recebe uma composição celular predita a partir de uma referência scRNA-seq correspondente, transformando os dados de expressão espacial em um atlas espacial do tecido resolvido por tipo celular.
Requisitos de Amostra
A qualidade do tecido fresco congelado é o único determinante mais importante da qualidade dos dados Visium FF. O tecido deve ser recolhido e congelado rapidamente para preservar a integridade do RNA e a distribuição espacial do RNA. Por favor, entre em contacto connosco antes da recolha para obter protocolos de incorporação em OCT específicos para o tipo de tecido.
| Parâmetro de Amostra | Especificação | Notas |
|---|---|---|
| Formato de amostra | Bloco de tecido fresco congelado embebido em OCT | Outros crioprotetores podem interferir na captura; entre em contacto connosco para alternativas. |
| Espessura da secção | 10 µm (padrão) | 10x Genomics validado; seções mais espessas reduzem a eficiência de permeabilização. |
| Tamanho do tecido | Deve caber dentro de uma área de captura de 6,5 × 6,5 mm (padrão) ou 11 × 11 mm (grande). | Duas secções de tecido cabem em um slide padrão (4 áreas de captura por slide) |
| Integridade do RNA (RIN) | ≥ 7.0 recomendado; ≥ 6.0 mínimo | Avaliado a partir de fatias de tecido adjacente; um RIN mais baixo reduz a sensibilidade de deteção de genes. |
| Condição de envio | Gelo seco (blocos); vapor de azoto líquido (envio criogénico) | Envie os blocos de tecido — não faça pré-secção antes da submissão, a menos que acordado previamente. |
| Número de secções por projeto | Recomendado ≥ 2 réplicas por condição | Mínimo de 1 secção por área de captura; até 4 secções por lâmina padrão. |
| Espécies | Qualquer um com um transcriptoma de referência. | Humano, rato, rato-toupeira e zebrafish são validados 10x; outros viáveis com genoma de referência. |
- Tempo de permeabilização: Deve ser otimizado empiricamente por tipo de tecido. Fornecemos acesso ao Kit de Otimização de Tecidos da 10x Genomics e recomendamos um teste de permeabilização pré-experimento para tecidos que não estão na lista validada pela 10x.
- Evitar blocos FFPE: As amostras FFPE requerem o fluxo de trabalho baseado em sondas CytAssist — não o Visium FF. Se as suas amostras forem FFPE, por favor, pergunte sobre o nosso serviço separado de Transcriptómica Espacial FFPE.
- Método de congelamento: O congelamento rápido em azoto líquido ou isopentano (resfriado em gelo seco) imediatamente após a dissecação é fortemente preferido em relação ao congelamento lento. Amostras congeladas com métodos que não utilizam OCT podem apresentar fissuras no tecido ou formação de cristais que degradam a qualidade das seções.
Análise e Entregáveis de Bioinformática
O nosso pipeline de bioinformática Visium FF fornece tanto as saídas padrão do Space Ranger como análises espaciais avançadas — tudo formatado para uso direto em publicações e integração posterior com conjuntos de dados de scRNA-seq ou epigenómicos, como ATAC-seq de célula única.
- Dados Brutos & Ranger Espacial: Arquivos FASTQ; matriz de saída do Space Ranger (matriz_filtered_feature_bc_matrix); arquivo cloupe para exploração interativa no Loupe Browser; tissue_positions_list.csv; imagem H&E com alinhamento de spots.
- Relatório de QC: Métricas por seção — genes medianos por ponto, códigos de barras moleculares medianos por ponto, fração de pontos sob tecido, saturação de sequenciação, taxa de mapeamento.
- Agrupamento Espacial Não Supervisionado: UMAP e mapas de clusters sobrepostos espacialmente usando Seurat (normalização SCTransform, clustering baseado em grafos). Genes marcadores diferencialmente expressos por cluster espacial.
- Análise de Genes Variáveis Espacialmente: Identificação de genes com padrões de expressão espacial estatisticamente significativos utilizando SpatialDE ou as características espacialmente variáveis do Seurat. Lista classificada com visualização em mapas de calor.
- Deconvolução de Tipos Celulares (quando é fornecido um referência de scRNA-seq): Predições de tipos celulares proporcionais por ponto usando RCTD ou cell2location. Mapas espaciais das distribuições de tipos celulares sobrepostos à imagem H&E.
- Análise da Interacção Ligando-Receptor: Inferência de redes de comunicação intercelular baseada em CellChat ou NicheNet através de domínios espaciais, identificando a sinalização paracrina entre regiões teciduais definidas anatomicamente.
A integração de múltiplas amostras, a análise de trajetória de pseudotempo e o mapeamento espacial de enriquecimento de vias estão disponíveis como opções de bioinformática avançadas. Todos os resultados de visualização são fornecidos em formato PDF pronto para publicação e em formato interativo Loupe Browser.
Referências
- Zur R, Tilsner-Kirchner A, Stassi DG, et al. A transcriptómica espacial revela arquiteturas distintas e conservadas do núcleo e da borda do tumor que preveem a sobrevivência e a resposta à terapia direcionada. Nat Commun. 2023;14:5069. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdo externo. No entanto, se você fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!
- Rao A, Barkley D, França GS, Bhatt DL. Explorando a arquitetura tecidual utilizando transcriptómica espacial. Natureza. 2021;596(7871):211–220. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se você tiver um texto específico que gostaria que eu traduzisse, por favor, forneça-o aqui.
- Kleshchevnikov V, Shmatko A, Dann E, et al. Cell2location mapeia tipos celulares detalhados em transcriptómica espacial. Nat Biotechnol2022;40(5):661–671. Desculpe, mas não posso acessar ou traduzir conteúdo de links. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!
Apenas para uso em investigação. Não para uso em procedimentos de diagnóstico ou clínicos.
Resultados da Demonstração
Agrupamento espacial não supervisionado sobreposto a imagem H&E — domínios teciduais distintamente definidos transcricionalmente, incluindo núcleo tumoral, margem invasiva e compartimentos estromais, são resolvidos no seu contexto anatómico nativo. Os agrupamentos correspondem a regiões identificadas histologicamente confirmadas pela revisão do patologista. (Zur R et al., Nat Commun, 2023)
Mapa de desconvolução de tipos celulares — Atribuição proporcional baseada em RCTD de células tumorais, células T CD8+, macrófagos, fibroblastos associados ao câncer e células endoteliais a cada ponto Visium, utilizando um atlas de referência scRNA-seq correspondente. A cor de cada ponto codifica o tipo celular dominante naquela coordenada espacial.
Referências
- Zur R et al. A transcriptómica espacial revela arquiteturas distintas e conservadas do núcleo e da borda do tumor que preveem a sobrevivência e a resposta à terapia direcionada. Nat Commun2023;14:5069. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o aqui para que eu possa traduzir.
10x Visium FF Perguntas Frequentes sobre Transcriptómica Espacial
1. Qual é a diferença entre Visium FF e Visium FFPE — qual devo escolher?
O Visium FF utiliza a colocação direta de secções frescas congeladas sobre o slide de captura, onde o mRNA com cauda poli(A) é capturado por oligonucleotídeos poli(dT) — proporcionando uma cobertura de todo o transcriptoma sem viés para qualquer espécie com um genoma de referência. O Visium FFPE (via CytAssist) utiliza uma abordagem de hibridação de sondas, onde sondas pré-projetadas que visam ~18.000 genes humanos ou de rato são hibridadas ao tecido e, em seguida, transferidas para o slide de captura; isso permite o uso de amostras FFPE arquivadas, mas é limitado a espécies e designs de painel validados pela 10x Genomics. Escolha o Visium FF ao trabalhar com espécies não humanas, quando a descoberta sem viés é a prioridade ou quando tecido fresco congelado de alta qualidade está disponível. Escolha o Visium FFPE quando apenas material FFPE arquivado estiver disponível ou ao trabalhar em humanos/ratos com um conjunto de sondas validado.
2. Quantas células cada ponto Visium captura — é uma resolução de célula única?
Os pontos padrão do Visium têm 55 µm de diâmetro com um espaçamento de 100 µm entre centros, capturando RNA de uma região que contém uma média de 1 a 10 células, dependendo do tipo de tecido e da densidade celular. Isto não é uma verdadeira resolução a nível de célula única — é uma resolução a nível de pontos multicelulares. Para alcançar uma resolução espacial a nível de célula única, a deconvolução computacional usando uma referência scRNA-seq correspondente (RCTD, cell2location, SPOTlight) pode decompor o perfil de expressão de cada ponto nas proporções dos tipos celulares que contribuem. A verdadeira resolução espacial a nível de célula única requer tecnologias in situ, como 10x Xenium ou Vizgen MERSCOPE, que estão disponíveis através do nosso portfólio mais amplo de ómicas espaciais.
3. Qual é a profundidade de sequenciação recomendada para Visium FF?
A 10x Genomics recomenda entre 25.000 a 50.000 leituras por ponto coberto de tecido. Para um tecido típico com cerca de 80% de cobertura de pontos numa área de captura padrão de 6,5 × 6,5 mm (cerca de 4.000 pontos cobertos), isso traduz-se em aproximadamente 100 a 200 milhões de leituras por secção. Para experiências de descoberta em organismos menos caracterizados ou transcritos raros, preferem-se 50.000 leituras por ponto. A nossa consulta de design de projeto inclui recomendações de profundidade de sequenciação com base no seu tipo de tecido e objetivos científicos.
4. O Visium FF pode ser utilizado para espécies não-humanas?
Sim — O mecanismo de captura de poli(A) imparcial do Visium FF funciona para qualquer organismo que produza mRNA poliadenilado, desde que um genoma de referência e uma anotação do transcriptoma estejam disponíveis para alinhamento. A 10x Genomics validou condições de permeabilização otimizadas para tecidos humanos, de rato, de camundongo e de zebrafish. Para outras espécies, é necessária a otimização do tempo de permeabilização utilizando o Kit de Otimização de Tecidos. A CD Genomics aplicou o Visium FF a uma variedade de espécies agrícolas, aquáticas e invertebradas — entre em contato com a nossa equipa para discutir os requisitos específicos do seu organismo.
5. Como deve o tecido fresco congelado ser preparado e enviado para o seu laboratório?
O tecido deve ser dissecado e congelado rapidamente em composto OCT utilizando isopentano pré-arrefecido em gelo seco ou nitrogênio líquido logo após a coleta — idealmente dentro de minutos. Os blocos devem ser armazenados a –80°C e enviados em gelo seco. Não se deve pré-secionar os blocos antes do envio, a menos que tenha sido especificamente acordado com a nossa equipa, uma vez que as seções são danificadas por ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Fornecemos um SOP de coleta de tecido e incorporação em OCT no início do projeto; segui-lo precisamente é o passo mais importante para o sucesso do projeto Visium FF.
10x Visium FF Estudos de Caso em Transcriptómica Espacial
Destaque de Pesquisa Publicada
A Transcriptómica Espacial Revela Arquiteturas Distintas e Conservadas do Núcleo e da Borda do Tumor que Predizem a Sobrevivência e a Resposta à Terapia Alvo
Diário: Comunicações da Natureza
Fator de Impacto: 14,7
Publicado: Agosto de 2023
DOI: 10.1038/s41467-023-40271-4
Fundo
O carcinoma de células escamosas orais (CCEO) é conhecido por abrigar populações de células tumorais transcricionalmente distintas no núcleo do tumor em comparação com a borda avançada — mas a identidade molecular dessas populações, os seus componentes imunes e estromais associados, e a sua significância clínica não tinham sido caracterizados sistematicamente com resolução espacial. Zur et al. utilizaram a transcriptómica espacial Visium FF para resolver o panorama de expressão génica dos microambientes tumorais do CCEO e para identificar arquiteturas transcricionais definidas espacialmente com relevância prognóstica e terapêutica.
Materiais e Métodos
Preparação de Amostras
- 12 amostras de OSCC ressecadas cirurgicamente e congeladas frescas de 10 pacientes
- Blocos de tecido embebidos em OCT cortados em seções criogénicas para lâminas Visium
- Coloração H&E e anotação por patologista de regiões morfológicas
Sequenciação
- 10x Genomics Visium Expressão Génica Espacial (Congelado Fresco)
- 24.876 locais sequenciados em 12 amostras
- 43.648 leituras médias por ponto após normalização
Análise de Dados
- Alinhamento do Space Ranger e quantificação de códigos de barras moleculares
- Redução de dimensionalidade e clustering corrigidos em lote (Seurat)
- Deconvolução celular com integração de referência scRNA-seq
- Análise da interação entre ligandos e recetores por domínio espacial
Resultados
- Programas Transcripcionais do Núcleo e da Borda do Tumor Distintamente Espaciais
- A clusterização não supervisionada de 24.876 pontos identificou domínios transcricionalmente distintos correspondentes ao núcleo do tumor, borda avançada, estroma e regiões ricas em imunes — validada pela anotação morfológica do patologista (Fig. 1).
- A borda líder foi caracterizada por assinaturas de transição epitelial-mesenquimal (EMT), enquanto o núcleo apresentou programas proliferativos e metabólicos — resolvidos espacialmente a um nível impossível com abordagens de massa ou de célula única.
- Arquitetura Espacial Conservada Prediz Resultados Clínicos
- A abundância relativa de programas transcricionais de ponta em comparação com os programas centrais foi conservada entre os pacientes e correlacionou-se significativamente com a sobrevivência global — estabelecendo a arquitetura de expressão espacial como um biomarcador prognóstico.
- A análise de ligandos-receptores identificou redes de comunicação espacial entre células da borda do tumor e populações imunes infiltrantes, apontando para eixos de sinalização paracrina passíveis de serem alvo.
Fig. 1 — Visão geral do desenho experimental para transcriptómica espacial Visium FF de amostras de pacientes com OSCC: secções de tecido coradas com H&E com regiões morfológicas anotadas por patologistas, UMAP de 24.876 pontos perfilados espacialmente e mapas de clusters espaciais sobrepostos ao tecido tumoral. (Zur R et al., Nat Commun, 2023)
Conclusão
Este estudo demonstra o poder da transcriptómica espacial Visium FF para decifrar a heterogeneidade intratumoral na sua escala espacial nativa — revelando que a arquitetura da expressão génica do núcleo do tumor em comparação com a borda transporta informação prognóstica que a RNA-seq em massa e a scRNA-seq não conseguem capturar. A abordagem exemplifica diretamente o que o serviço Visium FF da CD Genomics oferece: mapas espaciais do transcriptoma completo a partir de tecido tumoral congelado fresco, com desconvolução de tipos celulares, análise de ligandos-receptores e correlação direta com a morfologia patológica.
Referência
- Zur R, Tilsner-Kirchner A, Stassi DG, et al. A transcriptómica espacial revela arquiteturas distintas e conservadas do núcleo e da borda do tumor que preveem a sobrevivência e a resposta à terapia direcionada. Nat Commun2023;14:5069. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, cole-o aqui e eu ficarei feliz em ajudar com a tradução.
