Investigação Transcriptómica: Transcriptómica de Célula Única e Transcriptómica Espacial

Sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) e transcriptómica espacial são técnicas avançadas que apresentam vantagens únicas na elucidação da heterogeneidade celular e da arquitetura dos tecidos. Estas metodologias têm atraído uma atenção significativa em vários domínios de investigação.

Sequenciação de RNA de Célula Única

A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) representa uma abordagem inovadora para a sequenciação de mRNA em alta capacidade a nível de célula única. Esta técnica envolve a amplificação eficiente de quantidades mínimas de mRNA extraído de células individuais isoladas, seguida de sequenciação em alta capacidade. As aplicações da sequenciação de célula única abrangem vários campos, incluindo biologia do desenvolvimento, oncologia, neurociência, imunologia, o estudo dos mecanismos de doenças e a construção de atlas celulares.

Justificação para a Análise do Transcriptoma de Célula Única

As células não operam isoladamente; antes, colaboram para cumprir funções biológicas. Como diz o ditado, "nenhuma duas folhas são exatamente iguais", cada célula possui características únicas e desempenha papéis distintos no seu ambiente.

Métodos transcriptómicos tradicionais, como sequenciação de RNA em massa (O RNA-seq em massa) requer a moagem e extração de RNA total misto de organismos, tecidos ou populações celulares para sequenciação. Consequentemente, os dados resultantes representam perfis transcriptómicos médios de diversos constituintes celulares. Esta abordagem tende a ignorar as diferenças intercelulares e obscurece a heterogeneidade celular. Na verdade, o RNA-seq em massa muitas vezes descreve um estado hipotético, que pode não refletir com precisão o estado real das células individuais.

Em contraste, a tecnologia de scRNA-seq pode revelar a heterogeneidade e complexidade dos transcritos de RNA dentro de células únicas, bem como delinear a composição de vários tipos de células e funções em tecidos, órgãos e organismos altamente organizados. Este avanço tecnológico transformou profundamente o campo de transcriptómica.

Figura 1: Comparação entre scRNA-seq e Bulk RNA-seq

Vantagens Técnicas

Revelação da Heterogeneidade Celular e Análise de Alta ResoluçãoEsta técnica facilita a identificação de subpopulações celulares e tipos celulares raros, proporcionando uma visão abrangente das funções e estados celulares.

Investigação de Processos DinâmicosA scRNA-seq é adequada para explorar a evolução da expressão génica durante processos dinâmicos, como a diferenciação celular, a proliferação e a tumorigenese.

Agrupamento de Células ImparcialO método permite uma classificação mais precisa das células, particularmente nos campos da imunologia, oncologia e genética.

Implementação de Transcriptómica de Célula Única

A principal distinção entre o fluxo de trabalho operacional do scRNA-seq e RNA-seq em massa tradicional reside na necessidade de isolar células individuais. Um processo típico de scRNA-seq consiste nos seguintes passos: recolha de amostras, isolamento de células únicas, lise celular, transcrição reversa, amplificação de cDNA, construção de bibliotecas, sequenciação e análise de dados. As atuais plataformas de tecnologia scRNA-seq mais comuns incluem:

Plataformas MicrofluídicasExemplos incluem 10x Genomics, MobiNova e DNBelab C4, que utilizam chips microfluídicos e o princípio da imiscibilidade entre óleo e água para a isolação de células individuais.

Plataformas de MicroplacasPor exemplo, a plataforma BD Rhapsody utiliza a gravidade para facilitar a deposição de células em micro-poços para separação.

Transcriptómica Espacial

Transcriptómica espacial permite a deteção da expressão de todo o transcriptoma dentro das células, preservando a sua localização espacial no tecido. Esta abordagem permite uma exploração mais aprofundada da heterogeneidade espacial. As suas aplicações abrangem a identificação de tipos celulares raros, estudos de crescimento e desenvolvimento, exploração de mecanismos de doença e análise do microambiente tumoral.

Na sequenciação de células únicas, células de amostra podem ser perdidas durante a dissociação do tecido e o processamento microfluídico, levando potencialmente a distorções da informação. Além disso, a sequenciação de células únicas muitas vezes resulta na perda de dados de posição espacial para as células. A transcriptómica espacial aborda a deficiência de informação espacial que é inerente à transcriptómica de células únicas.

Vantagens Técnicas

Retenção de Informação EspacialEsta metodologia preserva as posições espaciais do mRNA dentro de secções de tecido, revelando interacções intercelulares e a estrutura organizacional, tornando-a particularmente aplicável a estudos envolvendo tecidos morfologicamente distintos, como o cérebro, embriões e bulbos olfactivos.

Análise Transcriptómica AbrangenteFornece uma visão abrangente da expressão de mRNA a nível celular, melhorando a compreensão da atividade celular dentro de tecidos complexos. Na investigação oncológica, esta técnica pode revelar gradientes de expressão génica e heterogeneidade dentro das regiões tumorais.

Implementação de Transcriptómica Espacial

Atualmente, existem vários métodos para implementar a transcriptómica espacial, incluindo técnicas de imagem baseadas em hibridização in situ e aquelas que dependem de sequenciação transcriptómica. Entre estas, a plataforma de sequenciação transcriptómica de alto rendimento, 10x Visiumé uma das tecnologias comerciais mais estabelecidas.

A plataforma 10x Visium utiliza tecnologia de microarray para depositar matrizes de oligonucleotídeos ordenados em lâminas de vidro. Subsequentemente, secções finas de tecido são colocadas sobre a matriz, e a permeabilização permite a difusão do RNA celular para oligonucleotídeos contendo códigos de barras. A transcrição reversa in situ gera cDNA com índices espaciais, que é então submetido a sequenciação de alto rendimento.

Figura 2: Princípios da Sequenciação de Transcriptómica Espacial 10x Visium

Análise Integrada de Dados de Transcriptómica de Célula Única e Espacial

Nos últimos anos, emergente tecnologias de transcriptómica espacial têm permitido a reconstrução da arquitetura dos tecidos e do posicionamento espacial celular. No entanto, a resolução dessas tecnologias muitas vezes não atinge a precisão a nível de célula única. Assim, a integração da transcriptómica espacial com a transcriptómica a nível de célula única pode criar mapas espaciais de célula única de alta resolução, resultando num efeito sinérgico que ultrapassa as aplicações individuais de cada técnica. As seções seguintes irão explorar os quadros conceptuais para a análise de associação dessas duas metodologias, complementadas por estudos de caso para ilustrar a sua aplicação.

Métodos e Princípios de Análise

Duas abordagens analíticas principais para integrar dados transcriptómicos de célula única com dados transcriptómicos espaciais são a deconvolução e o mapeamento. Fundamentalmente, estes métodos envolvem a integração de mapas de célula única, conforme fornecido pela transcriptómica de célula única, com mapas espaciais derivados da transcriptómica espacial, construindo assim um atlas espacial de célula única. As seções subsequentes irão enfatizar as estratégias analíticas e metodologias empregues neste processo de integração.

Figura 3: Abordagens Estratégicas para a Análise Integrativa de Transcriptómica de Célula Única e Espacial

Deconvolução

A deconvolução refere-se ao processo de separação de sinais transcriptómicos mistos obtidos a partir de amostras espacialmente resolvidas nos seus tipos celulares constituintes. Ao aproveitar os perfis transcriptómicos de célula única, este método permite a estimativa da abundância de diferentes tipos celulares dentro de regiões espaciais específicas de uma amostra de tecido.

Mapeamento

O mapeamento envolve a alinhamento de dados de transcriptómica de célula única na estrutura da transcriptómica espacial. Este método permite a visualização de perfis de expressão de célula única no contexto da arquitetura tecidual, facilitando uma compreensão mais profunda das interações celulares e estados funcionais in situ.

A integração destas metodologias apresenta uma estratégia poderosa para elucidar as complexidades da organização dos tecidos e do comportamento celular. Através da aplicação cuidadosa de técnicas de deconvolução e mapeamento, os investigadores podem obter insights inestimáveis sobre a composição celular e a dinâmica funcional de vários sistemas biológicos.

Características Genéticas Celulares

A construção de mapas espaciais de células individuais permite investigar os padrões de distribuição de subpopulações celulares-alvo, bem como a distribuição espacial e específica de subpopulações de genes-alvo. Subsequentemente, pode ser realizada uma análise diferencial de genes e uma análise de enriquecimento para identificar os genes com a maior regulação positiva como genes característicos da subpopulação, elucidando assim a sua distribuição em subpopulações celulares espaciais e diversas.

Localização e Correlação

Uma análise adicional pode explorar a co-localização de genes e células, revelando interações receptor-ligando e relações regulatórias transcricionais, bem como interações intercelulares. Além disso, regiões espaciais, células e genes podem estar correlacionados com dados de fenótipo tecidual, permitindo a investigação da relação entre distribuições de características espaciais e funções fenotípicas.

Trajetórias de Desenvolvimento

Subsequentemente, a análise de pseudo-tempo espacial pode ser utilizada para construir as trajetórias de diferenciação de pseudo-tempo espacial das células. Ao combinar a análise de genes diferenciais, podem ser identificados genes de características de desenvolvimento espacialmente relevantes e genes que impulsionam a diferenciação de subpopulações, iluminando assim os mecanismos regulatórios da diferenciação do desenvolvimento celular. Além disso, a análise de velocidade de RNA pode ajudar a inferir a dinâmica direcional da diferenciação celular, servindo para validar os resultados obtidos a partir das análises de pseudo-tempo.

Comunicação Celular

Além disso, informações sobre as relações de interação entre subpopulações celulares podem ser obtidas a partir de dados de posicionamento espacial e interações entre recetores e ligandos. Após identificar pares de células interativas chave, pode-se prosseguir com uma investigação mais aprofundada sobre os pares de genes de recetores e os mecanismos regulatórios moleculares, bem como análises das diferenças entre grupos para avaliar o impacto dos tratamentos experimentais na comunicação celular.

Regulação Genética

Finalmente, a integração da análise de fatores de transcrição e da análise de redes pode facilitar a construção de redes regulatórias transcricionais. Esta abordagem permite a identificação de genes e fatores de transcrição chave, bem como a análise da sua co-expressão espacial, revelando assim os mecanismos regulatórios de vias críticas e as suas associações com fenótipos.

Casos de Aplicação

As seções subsequentes irão ilustrar como as estratégias de pesquisa mencionadas são aplicadas através de dois estudos de caso específicos.

Estudo de Caso 1

Num artigo de 2023 publicado em Célula (Impact Factor = 45.5), os autores realizaram transcriptómica de célula única e transcriptómica espacial em várias regiões do cérebro humano nas 6-23 semanas de gestação (GW). Este estudo construiu um atlas espaciotemporal do cérebro humano, revelando os padrões de distribuição espacial de diferentes tipos de células (ver Figura 2AB). Os autores exploraram ainda a heterogeneidade das células progenitoras neurais humanas (NPCs), classificando-as em cinco subpopulações. Entre estas, as células gliais radiais (RG) emergiram como a população mais precoce, exibindo uma heterogeneidade regional significativa. Além disso, o fator de transcrição TFAP2C foi especificamente expresso nas células RG e foi encontrado como determinante do seu destino. Este estudo utilizou efetivamente a primeira estratégia de pesquisa para investigar as características de distribuição espacial das subpopulações celulares dentro do cérebro humano.

Figura 4: Atlas Transcricional Espatiotemporal do Desenvolvimento do Cérebro Humano

Subsequentemente, os autores empregaram a análise de pseudo-tempo para reconstruir as trajetórias de desenvolvimento de subpopulações neuronais específicas de cinco regiões cerebrais distintas. Observou-se que as células gliais radiais corticais (vRG e oRG) se diferenciam em células progenitoras intermediárias específicas do cérebro (IPC) e células precursoras (Prec2), desenvolvendo-se, em última instância, em neurônios glutamatérgicos corticais (Glu1 e Glu4). Além disso, as Sp-RG na eminência ganglionar (GE) progridem em direção a neurônios GABAérgicos no córtex.

Além disso, as células gliais radiais no diencéfalo (Dien RG-1) tendem a diferenciar-se em neurónios GABAérgicos LHX6+, enquanto o Dien RG-2 está direcionado para o desenvolvimento de neurónios glutamatérgicos. Os resultados da visualização espacial demonstram que o Dien RG-1 e os neurónios GABAérgicos LHX6+ estão principalmente localizados na região ventral do diencéfalo, enquanto o Dien RG-2 e os neurónios glutamatérgicos diencéfalos estão predominantemente situados na região dorsal. Esta distribuição espacial corrobora ainda mais as conclusões derivadas da análise de dados de células individuais.

Em resumo, a terceira estratégia de investigação foi utilizada para explorar o desenvolvimento de subtipos neuronais específicos em diferentes regiões do cérebro através da análise de pseudo-tempo espacial.

Figura 5: Análise da Distribuição Espacial do Pseudo-Tempo das Subpopulações de Células-Alvo

Finalmente, os autores realizaram uma análise de comunicação celular para investigar as interações entre células gliais e neurónios GABAérgicos. Observou-se que os genes associados a ligandos NCAM1 e NRXN1 apresentaram altos níveis de expressão em células precursoras de oligodendrócitos precoces (OPC-1) e GABA-7, enquanto os genes associados a recetores L1CAM e NLGN1 estavam enriquecidos em GABA-7 e OPC-1 precoces, respetivamente (ver Figura 4A). Estas interações foram predominantemente identificadas no diencéfalo ventral (DV).

Além disso, a análise revelou interações entre células gliais e neurónios de outras regiões. O OPC-2 inicial foi encontrado localizado na fronteira entre o córtex (Cor) e o subpálio (Sp), enquanto os neurónios glutamatérgicos Glu1 e Glu4 secretaram o ligando NRG1, que atraiu os OPCs a migrar em direção ao córtex.

Em resumo, a quarta estratégia de pesquisa foi utilizada para elucidar as interações entre as células gliais e os neurónios, bem como para caracterizar as preferências de distribuição espacial das células gliais durante o processo de desenvolvimento.

Figura 6: Distribuição Espacial e Interacções das Células Gliais

Estudo de Caso Dois

Num estudo publicado em Descoberta Celular (No fator de impacto = 33,5) em 2024, os autores realizaram uma análise espacial de multi-ópticas de célula única do cerebelo humano. A investigação identificou linhagens GABAérgicas, como interneurônios e células de Purkinje (PKCs), bem como linhagens excitatórias, incluindo células em escova unipolares (UBCs), progenitores de células granulares (GC) e GCs pós-mitóticos.

A análise revelou que a abundância das PKCs atingiu o pico na 13. semana gestacional (GW13) e, subsequentemente, exibiu um declínio acentuado. Os dados de transcriptómica espacial indicaram uma distribuição multicamada e circunferencial de diferentes tipos de células na GW13, correspondendo à camada externa de grânulos (oEGL), camada interna de grânulos (iEGL), zona intermédia (IZ) e zona ventricular (VZ). Na 16. semana gestacional (GW16), também foram detectadas separações notáveis do lábio rombóide (RL), camada de grânulos externos (EGL) e camada de células de Purkinje (PCL).

Em resumo, este estudo utilizou a primeira estratégia de pesquisa para investigar as características de distribuição espacial das subpopulações celulares cerebelares.

Figura 7: Mapa Transcriptómico Temporal e Espacial do Desenvolvimento Cerebelar Humano

Na análise subsequente, os autores empregaram a análise de pseudo-tempo para reconstruir a trajetória de desenvolvimento das linhagens de células granulares (CGs). Os progenitores de células granulares (PCGs) foram categorizados em duas populações distintas: PCGs ATOH1+ (AT+PCGs) e PCGs NEUROD1+ (ND+PCGs). Na 13.ª semana de gestação (GW13), os ND+PCGs foram observados posicionados abaixo dos AT+PCGs, exibindo uma separação interna-externa distinta na sua distribuição.

Uma análise adicional envolveu a seleção de fatores de transcrição que estavam enriquecidos em células progenitoras ou pós-mitóticas para a análise da rede regulatória gênica (GRN). Esta abordagem teve como objetivo identificar genes-chave que possam regular transições de estado celular durante a diferenciação de células germinativas (GC). Foi revelado que, além de ATOH1, fatores de transcrição como YBX3 e MEF2C também podem desempenhar papéis no desenvolvimento de GC.

Em resumo, este estudo utilizou as terceiras e quintas estratégias de pesquisa para investigar a diferenciação e os mecanismos regulatórios da linhagem GC.

Figura 8: Distribuição Espacial das Linhagens de Células Granulares e Rede Reguladora de Diferenciação

Resumo

Em conclusão, a aplicação combinada de transcriptómica de célula única e transcriptómica espacial facilita a integração de informações espaciais com resolução de célula única. Esta abordagem permite uma exploração abrangente das características de distribuição das subpopulações celulares, diferenciação desenvolvimental, interações e mecanismos regulatórios a partir de múltiplas dimensões.

Referências:

1. Longo S K, Guo M G, Ji A L, et al. Integração de transcriptómica de célula única e espacial para elucidar a dinâmica intercelular dos tecidos. Nature Reviews Genetics, 2021, 22(10): 627-644.
2. Li Y, Li Z, Wang C, et al. O atlas transcriptómico espaciotemporal revela a especificação regional do cérebro humano em desenvolvimento. Célula, 2023, 186(26): 5892-5909. e22.
3. Yang F, Zhao Z, Zhang D, et al. Análise multi-ômica de célula única do desenvolvimento de linhagens e organização espacial no cerebelo fetal humano. Descoberta da Célula, 2024, 10(1): 22.