Sequenciação de RNA de Célula Única de Microorganismos

A Sequenciação de RNA de Célula Única (scRNA-seq) tem sido instrumental na revelação de insights críticos dentro de sistemas mamíferos, enriquecendo a nossa compreensão da diversidade transcricional entre tipos e estados celulares. Igualmente fundamental é a necessidade de descobrir a heterogeneidade de expressão ao nível de célula única em bactérias e microbiomas.

Embora a scRNA-seq tenha feito avanços significativos na elucidação das complexidades das células eucarióticas, incluindo plantas e animais, e se tenha tornado uma pedra angular na investigação biológica, a tecnologia de scRNA-seq microbiana enfrenta desafios formidáveis. Estes obstáculos incluem:

• Baixa Abundância de mRNA: O conteúdo de mRNA bacteriano é notavelmente escasso, aproximadamente duas ordens de magnitude inferior ao encontrado em mamíferos.
• Ausência de PolyA: Ao contrário dos seus homólogos eucarióticos, o mRNA bacteriano não possui a estrutura de polyA na sua extremidade 3', tornando a sua captura e análise uma tarefa complexa.
• Meia-vida curta do mRNA: O mRNA bacteriano tem uma meia-vida substancialmente mais curta em comparação com o mRNA mamífero, o que exige um processamento rápido e eficiente.
• Espessura da Parede Celular: As células bacterianas apresentam paredes celulares mais espessas, o que representa obstáculos à lise completa e à liberação eficiente de mRNA para análise.
• Desafios do Tamanho Microbiano: O tamanho diminuto das células microbianas agrava a dificuldade de isolar células únicas para análise.

Nos últimos anos, cientistas dedicados têm perseguido inovações técnicas, resultando no desenvolvimento de várias metodologias de sequenciação de RNA de células bacterianas individuais, incluindo microSPLIT e BacDrop.

Fluxo de trabalho de sequenciação e análise de células únicas para abordagens de sequenciação de células únicas padrão (não direcionadas) e direcionadas. (Woyke et al., 2017)

Sequenciação de RNA de Células Únicas Eucarióticas (scRNA-seq)

Na investigação contemporânea, o scRNA-seq eucariota evoluiu para uma técnica amplamente utilizada, com uma vasta gama de experiências, abordagens analíticas e várias plataformas disponíveis comercialmente.

Utilizando um modelo de infecção por macrófagos, a scRNA-seq revelou a rápida polarização das células hospedeiras infectadas por Salmonella, uma observação que escapou às técnicas de RNA-seq de pool misto. Esta análise revelou ainda que a Salmonella em replicação ativa habita predominantemente macrófagos M2 anti-inflamatórios e suscetíveis, enquanto as bactérias não replicantes estão principalmente localizadas em macrófagos M1 pró-inflamatórios. Notavelmente, a taxa de replicação bacteriana correlaciona-se com a extensão da resposta de interferão do hospedeiro. A integração dos dados de scRNA-seq com os correspondentes Sequenciação de RNA dual dados estabeleceram uma ligação entre a expressão de um fator de virulência específico da Salmonella e a polarização de macrófagos. A Salmonella manipula ativamente as células do hospedeiro para criar um ambiente favorável à replicação, refletindo a estratégia de virulência de Mycobacterium tuberculosisEstes conjuntos de dados de célula única representam um recurso valioso para explorar a heterogeneidade de diferentes tipos de células hospedeiras.

Uma limitação da scRNA-seq convencional é a sua dependência de poli(A) para capturar transcritos, resultando na perda de informação sobre transcritos que não possuem caudas de poli(A), como os transcritos não codificantes. Para enfrentar este desafio, os investigadores desenvolveram um método baseado em junções de extremidade 3' chamado Small-seq, que permite a deteção de miARNs, tARNs e snoARNs em células únicas de mamíferos. Outro método, Holo-seq, examina tanto sARNs como mARNs dentro de uma única célula. Embora o estado atual da biologia da infeção se incline para investigações focadas em mARN, os investigadores estão a direcionar cada vez mais a sua atenção para as interações que envolvem transcritos não codificantes entre micróbios e os seus hospedeiros. Por exemplo, em células humanas infectadas por Salmonella, os perfis de lncRNA exibem mudanças mais rápidas do que os mARNs, com certos lncARNs do hospedeiro a demonstrar a capacidade de reduzir a suscetibilidade à infeção por Salmonella. Além disso, alguns sARNs bacterianos altamente conservados servem como reguladores críticos, enquanto certos miARNs contribuem para a defesa do hospedeiro contra patógenos, e outros são ativamente explorados pela Salmonella para facilitar a patogénese. O estudo de transcritos não codificantes nas interações hospedeiro-micróbio apresenta promessas para um desenvolvimento futuro.

Sequenciação de RNA de Células Únicas Bacterianas

A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) em bactérias enfrentou desafios técnicos significativos que dificultaram a sua aplicação generalizada em procariotos. Estes obstáculos incluem fatores como o pequeno tamanho das células, a complexidade da separação celular, a presença de paredes celulares rígidas e a ausência de caudas de poliA nas moléculas de mRNA. Como resultado, a adoção do scRNA-seq na investigação bacteriana ainda está em fase inicial.

Várias novas tecnologias de deteção do transcriptoma bacteriano foram desenvolvidas para enfrentar estes desafios. Métodos notáveis incluem MATQ-seq, MicroSPLiT, PETRI-seq, scDual-seq e a tecnologia PatH-Cap. Notavelmente, o scDual-seq e o PatH-Cap foram especificamente concebidos para a deteção de bactérias intracelulares. Por exemplo, os cientistas utilizaram o MATQ-seq para analisar Salmonella typhimurium e Pseudomonas aeruginosa Após a isolação das células, a análise comparativa com dados de RNA-seq de misturas tradicionais revelou que o MATQ-seq se destaca na captura precisa dos padrões de expressão de genes dependentes do crescimento.

Fluxo de trabalho MATQ-seq melhorado para RNA-seq de célula única bacteriana. (Homberger et al., 2023)

Noutro estudo, o PETRI-seq foi utilizado para investigar E. coli e Staphylococcus aureus, capturando aproximadamente 200-300 mRNAs por bactéria. Entretanto, o microSPLiT foi aplicado a indivíduos. Bacillus subtilis e E. coli células, detectando uma média de mais de 300 cópias de mRNA por bactéria. Embora esses métodos tenham alcançado o sequenciamento do transcriptoma de uma única bactéria, ainda ficam atrás dos seus homólogos eucarióticos em termos de rendimento celular, taxas de captura de mRNA/gene e profundidade de sequenciamento de genes.

O campo do RNA-seq de célula única microbiana está a evoluir rapidamente, com tecnologias de RNA-seq de bactérias únicas para espécies Gram-negativas e Gram-positivas ainda a emergir. Embora a fase de prova de conceito esteja a aproximar-se da conclusão, a próxima fronteira envolve o estudo de comunidades microbianas naturais onde bactérias individuais podem possuir apenas um número limitado de mRNAs, frequentemente não excedendo algumas centenas. Para avançar nesta área, é essencial desenvolver técnicas eficientes de lise e remoção de rRNA para bactérias individuais utilizando protocolos baseados em CRISPR. Além disso, o desenvolvimento de dispositivos baseados em microfluídica para simplificar o manuseio de amostras é crucial.

As comunidades microbianas podem exibir uma organização espacial definida com funções específicas tanto em estados saudáveis como doentes, necessitando da integração de scRNA-seq com técnicas de imagem avançadas para decifrar essas relações. Por fim, desvendar os papéis de subgrupos microbianos ao longo do tempo e em diferentes contextos espaciais será fundamental para o desenho de intervenções terapêuticas direcionadas.

Referências:

1. Homberger, Christina, et al. "Melhoria do RNA-seq de células bacterianas individuais através de MATQ-seq automatizado e remoção baseada em Cas9 de leituras de rRNA." Mbio 14.2 (2023): e03557-22.
2. Woyke, Tanja, Devin FR Doud e Frederik Schulz. "A trajetória do sequenciamento de células únicas microbianas." Métodos da Natureza 14.11 (2017): 1045-1054.