Visão Geral da Sequenciação de RNA de Célula Única: Aplicações, Análise de Dados e Vantagens

A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) é uma técnica para sequenciar o RNA de uma única célula e tem-se desenvolvido rapidamente nos últimos anos. Apresenta vantagens na identificação de células a nível molecular e na interpretação da heterogeneidade celular, sendo agora amplamente aplicada em investigação médica e biológica.

Breve história do desenvolvimento do scRNA-seq

No início da década de 1990, surgiu a tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa em tempo real para um pequeno número de genes em uma única célula. ^[1]O verdadeiro scRNA-seq foi proposto em 2009 por Tang et al., que sequenciaram o transcriptoma de um pequeno número de células germinais primordiais de rato.^[2]Desde então, uma multitude de tecnologias de scRNA-seq foram desenvolvidas, incluindo o STRT-seq.^[3], CEL-seq^[4], SMART-seq^[5]e tecnologias subsequentes de nanogotas, tecnologias de picowell e tecnologias de codificação in situ para sequenciação de alto rendimento. Antes de 2014, a maioria das plataformas de scRNA-seq estava limitada à análise de menos de 100 células, e o custo da sequenciação era elevado. O surgimento de tecnologias subsequentes, como o Drop-Seq^[6] e inDrop^[7] têm permitido o sequenciamento de alto rendimento. Em 2017, o surgimento de duas plataformas comerciais de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), 10X Genomics e BD Rhapsody, tornou o scRNA-seq mais amplamente utilizado, sendo ainda as plataformas mais utilizadas hoje em dia. Desde então, tecnologias de scRNA-seq como Microwell-seq^[8] e DNBelab C4^[9] reduziram ainda mais os custos de sequenciação e aumentaram o rendimento celular. Dividi as diferentes tecnologias em duas categorias, nomeadamente, tecnologia de sequenciação por etiquetas e tecnologia de sequenciação de comprimento total. Devido à iteração das tecnologias, os métodos de sequenciação propostos em diferentes estágios devem ter as suas vantagens e limitações (Fig.1).

Fig. 1 Linha do tempo de desenvolvimento das tecnologias de transcriptoma de célula única^[10]

Diferenças entre scRNA-seq e Bulk RNA-seq

tanto scRNA-seq como RNA-seq em massa sequenciar o transcriptoma de uma amostra e partilhar processos anteriores, como extração de RNA, transcrição reversa para cDNA e preparação da biblioteca para sequenciação^[11]A sua diferença fundamental reside na amostra: o scRNA-seq trata cada célula individual como uma amostra separada, enquanto o Bulk RNA-seq utiliza um grupo de células como uma única amostra. Para alcançar a isolação de células únicas e a preparação da biblioteca do transcriptoma, o scRNA-seq requer instrumentos mais avançados e gera um volume de dados significativamente maior, tornando-o mais caro. Devido aos seus dados de alta resolução, o scRNA-seq pode detectar tipos celulares raros que o Bulk RNA-seq pode ignorar, tornando-o particularmente vantajoso em estudos que envolvem tipos celulares complexos, como o microambiente tumoral (TME) (Fig.2). Cada técnica tem as suas forças, e o método apropriado deve ser escolhido com base na questão de pesquisa específica.

Fig.2 scRNA-seq versus RNA-seq em massa para perfilagem do TME^[12].

Análise de Dados de scRNA-seq

A análise precisa e eficaz de dados de scRNA-seq é crucial para a investigação científica. Assim, os métodos de análise de dados de scRNA-seq estão continuamente a ser desenvolvidos e aprimorados. Aqui, iremos delinear os passos típicos na análise de dados de célula única (Fig. 3).

Fig.3 Esquema de um fluxo de trabalho típico de análise de RNA-seq de célula única^[13].

Controlo de Qualidade e Pré-processamento de Dados de scRNA-seq

Após obter dados de scRNA-seq, a primeira tarefa é realizar o controlo de qualidade. Este passo inclui a avaliação da qualidade das leituras de sequenciação, a filtragem de células de baixa qualidade e a remoção da contaminação de RNA ambiente. Ferramentas de controlo de qualidade concebidas para dados de RNA-seq em massa, como o Trimmomatic.^[14], Fastp^[15]e Cutadapt^[16], também são adequados para o pré-processamento de dados brutos de scRNA-seq. Normalmente, ao processar dados de scRNA-seq descarregados da web, utilizo o TrimGalore, uma ferramenta que integra o Cutadapt e o FastQC (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). O FastQC é outra ferramenta publicada no GitHub que pode avaliar a qualidade das leituras de sequenciamento (https://github.com/s-andrews/FastQC). No processo de análise específico, utilizo o FastQC para primeiro avaliar se os dados brutos de sequenciamento necessitam de um controle de qualidade adicional. Se a avaliação mostrar anomalias, como a presença de adaptadores, leituras de baixa qualidade ou um número excessivo de fragmentos duplicados, então utilizo o TrimGalore para a limpeza dos dados. Após o controle de qualidade das leituras, o próximo passo envolve alinhar as leituras de sequenciamento ao genoma de referência e gerar uma matriz de dados quantitativos. Para este processo, utilizo ferramentas integradas de alinhamento e quantificação, como o CellRanger, desenvolvido pela 10X Genomics.^[17]Fornece uma solução abrangente para gerar matrizes de dados de transcriptoma de célula única a partir de dados de sequenciação brutos, oferecendo um método de processamento de dados fiável para a investigação de célula única.

Após obter a matriz de dados, normalmente precisamos identificar duplicados e células vazias. Números anormalmente altos de leituras e genes podem indicar a presença de duplicados. Costumo usar ferramentas de deteção de duplicados, como o DoubletDecon.^[18] e DoubletFinder^[19] para excluir duplicados. Além disso, uma alta proporção de genes mitocondriais e um baixo número de genes geralmente sugerem uma má qualidade celular. A contaminação por RNA ambiente refere-se ao RNA presente na suspensão de células únicas que é detectado juntamente com o RNA interno da célula durante a formação de gotículas, mesmo que não esteja realmente presente na célula. Para remover esta contaminação, utilizo o DecontX.^[20] para prever rapidamente e corrigir a contaminação de RNA ambiental, e depois prosseguir com a análise subsequente utilizando a matriz de dados corrigida.

A normalização é o primeiro passo no processamento de dados de matriz de scRNA-seq e impacta diretamente a precisão dos resultados da análise subsequente. Um método de normalização comumente utilizado assume que cada célula tem o mesmo número inicial de transcritos e simplesmente normaliza os dados para contagens por milhão (CPM). A normalização logarítmica de dados baseados em códigos de barras moleculares, como implementado no Seurat, é um dos métodos mais amplamente utilizados. ^[21]. Outros métodos, como sctransform^[22], BayNorm^[23]e SCnorm^[24], também pode ser utilizado para normalizar dados de scRNA-seq. Para métodos de sequenciação de comprimento total como o SMART-seq, o comprimento do transcrito é geralmente considerado durante o processamento dos dados.

Integração de Dados de Sequenciação de Transcritos de Diferentes Lotes

Atualmente, os dados de scRNA-seq tornaram-se altamente abundantes, e a integração eficaz de dados de diferentes lotes tornou-se um novo desafio. Os efeitos de lote implicam diferenças técnicas que surgem quando as amostras provêm de diferentes lotes, que podem resultar de fatores como diferentes pontos no tempo, diferentes operadores, variações nos protocolos de scRNA-seq ou inconsistências nas amostras de sequenciação. Portanto, vários métodos foram desenvolvidos especificamente para eliminar os efeitos de lote nos dados de scRNA-seq. Os métodos de integração de dados comumente utilizados incluem o Seurat.^[21], MNN^[25]Harmonia^[26], e Conos^[27]Eu uso com mais frequência o algoritmo CCA incluído no Seurat e no Harmony. O Harmony elimina efeitos de lote enquanto preserva as diferenças biológicas entre as duas amostras, enquanto o CCA aplica uma correção mais forte, que pode potencialmente apagar as diferenças biológicas entre as amostras.

Identificação e Anotação de Tipos Celulares

Na análise de dados de célula única, a identificação e anotação precisas dos tipos celulares é um passo crítico para todas as análises subsequentes. Este processo inclui etapas como seleção de características, redução de dimensionalidade, agrupamento e anotação. O primeiro passo na redução de dimensionalidade para dados de scRNA-seq é a seleção de características, onde o conjunto de dados é filtrado para reter apenas os genes que contribuem significativamente para a variabilidade dos dados. Esses genes retidos são conhecidos como genes altamente variáveis.^[28] (HVGs). O número de HVGs varia tipicamente entre 1.000 e 5.000 e precisa ser ajustado com base na complexidade do conjunto de dados. Após selecionar os HVGs, a dimensionalidade da matriz de expressão scRNA-seq precisa ser reduzida ainda mais, descrevendo os dados com muito menos dimensões do que o número de genes, geralmente em duas ou três dimensões. Os métodos comuns de redução de dimensionalidade incluem agora abordagens lineares e não lineares, com Análise de Componentes Principais.^[29] (PCA) sendo o método linear mais popular. A análise PCA é tipicamente utilizada como um passo de pré-processamento para a redução de dimensionalidade não linear, e o número de componentes principais (CPs) selecionados para o próximo passo pode afetar a interpretação dos resultados subsequentes. Os métodos de redução de dimensionalidade não linear permitem a visualização de dados em duas ou três dimensões. Os métodos mais comumente utilizados incluem a incorporação de vizinhos estocásticos distribuídos t.^[30] (t-SNE) e aproximação e projeção uniforme de variedades^[31] (UMAP). O objetivo da agrupamento de células é agrupar células com base na semelhança dos seus padrões de expressão genética, de forma a obter subpopulações biologicamente significativas. O agrupamento baseado diretamente em distâncias de matriz é um processo de aprendizagem de máquina não supervisionado, sendo o agrupamento k-means um método amplamente utilizado.^[25]A anotação precisa dos clusters obtidos a partir da agrupamento é um passo fundamental na análise de dados de scRNA-seq. Atualmente, este processo é tipicamente realizado através de métodos de anotação manuais e automáticos. A anotação manual envolve a correspondência dos genes característicos de cada cluster com a literatura publicada e bases de dados, atribuindo então identidades celulares biologicamente significativas aos clusters. Por exemplo, a tabela abaixo resume alguns genes marcadores para vários tipos celulares (Tabela 1).

Tabela 1 Genes Marcadores para Tipos Comuns de Células T

Aplicações Comuns da Análise de Dados Downstream na Investigação de Células Únicas

A interpretação multifacetada de células anotadas é parte da análise posterior dos dados de scRNA-seq. As análises comuns incluem alterações na composição celular, análise diferencial ao nível do gene, inferência de trajetórias e análise da comunicação célula a célula.

As alterações na composição celular referem-se à variação nas proporções de vários tipos de células entre diferentes grupos (por exemplo, grupos de controlo e experimentais). Por exemplo, pode haver um aumento na proporção de células progenitoras de neutrófilos na medula óssea de camundongos selvagens portadores de tumores.^[38]Normalmente, visualizações como gráficos de barras, gráficos de área ou gráficos de pizza são utilizados para apresentar as alterações nas proporções celulares entre diferentes grupos.

A análise diferencial a nível genético abrange vários aspectos, incluindo o cálculo de genes diferencialmente expressos entre grupos, análise de enriquecimento de conjuntos de genes e inferência de redes regulatórias de fatores de transcrição. Através destas análises, as diferenças na expressão génica em diferentes contextos podem ser caracterizadas, revelando alterações a nível dos genes. Para melhor interpretar o significado biológico destes genes, os investigadores agrupam-nos com base em processos biológicos comuns. Estes conjuntos de genes provêm tipicamente de bases de dados como a MSigDB.^[39] e Ontologia Genética^[40], bem como bases de dados de vias como o KEGG^[41] e Reactome^[42]A função dos genes não é realizada de forma independente; os fatores de transcrição desempenham um papel crucial na regulação da expressão génica. Ao utilizar a análise da rede regulatória de fatores de transcrição, podem ser reveladas interações entre fatores de transcrição e outros genes. Atualmente, existem ferramentas especializadas para esta análise com base em scRNA-seq, como o SCENIC.^[43].

Para caracterizar as mudanças contínuas entre células, é necessário construir modelos dinâmicos de expressão genética, e esses métodos são referidos como inferência de trajetória (TI). A TI organiza as células com base nas mudanças transcricionais, e este caminho é considerado como pseudotempo no desenvolvimento celular.^[44]Desde a criação da Monocle^[45] para TI, vários algoritmos foram rapidamente desenvolvidos.

A comunicação célula-a-célula refere-se a interações mediadas por receptores-ligandos ou outros fatores auxiliares, que são cruciais para processos biológicos como o desenvolvimento celular e a progressão de doenças. Prever a comunicação celular requer a matriz de expressão scRNA-seq e relações de emparelhamento de receptores-ligandos conhecidas. Atualmente, as ferramentas comumente utilizadas para este fim incluem o CellphoneDB.^[46], CellChat^[47]e NicheNet^[48].

Aplicações de scRNA-seq

As aplicações do scRNA-seq são extensas, abrangendo múltiplos campos da biologia e medicina. Aqui, resumo as suas aplicações em oncologia, imunologia, biologia do desenvolvimento e neurociência.

Aplicações de scRNA-seq em Oncologia

A scRNA-seq tem sido amplamente utilizada na investigação de tumores humanos, incluindo estudos sobre heterogeneidade tumoral, microambiente tumoral (TME) e interações celulares. A heterogeneidade tumoral abrange diferenças entre tumores, bem como variações dentro de um único tumor. Identificar com precisão a heterogeneidade tumoral desempenha um papel crucial no diagnóstico e tratamento de doenças.^[49]. Durante et al. descobriram uma complexidade genómica sub-clonal e estados transcricionais previamente não reconhecidos no melanoma.^[50]O TME é um ecossistema complexo composto por células cancerígenas, várias células não malignas, matriz extracelular, fatores secretados e vasculatura tumoral. Zheng et al. revelaram que células T e NK exauridas, células Treg, macrófagos ativados seletivamente e células dendríticas tolerogénicas dominam o TME no câncer esofágico.^[51]A comunicação entre macrófagos e Tregs contribui para a potencial supressão imunitária dentro do TME. As interações entre células concentram-se principalmente nas interações entre células malignas e o TME ou células originárias do TME. Wei Zhuo et al. descobriram um mecanismo em que a sinalização mediada por Cadherina 11 entre células de câncer gástrico e fibroblastos promove a metastização do câncer gástrico.^[52].

Aplicações de scRNA-seq em Imunologia

A scRNA-seq pode ser utilizada para analisar de forma abrangente diferentes tipos de células no sistema imunitário, revelando diferenças funcionais entre várias células imunes em estados de saúde e doença. Entre todas as células imunes, os estudos de scRNA-seq sobre células T são os mais numerosos, uma vez que a doença está frequentemente associada a alterações no estado das células T. Por métodos convencionais, foram identificados subtipos clássicos de células T, incluindo células T naïve, de memória e efetoras. No entanto, a scRNA-seq destes subtipos clássicos revelou novas descobertas sobre a exaustão.^[53]células T citotóxicas e imunossupressoras^[54]Além de identificar novos tipos de células, a scRNA-seq também pode analisar o impacto das doenças nas células imunes e ajudar a compreender os mecanismos das doenças. Por exemplo, as células supressoras derivadas de mieloides, que se diferenciam a partir de Progenitores de Granulócitos-Monócitos, acumulam-se em grandes quantidades dentro do TME.^[55]Estas células infiltram tumores e promovem diretamente a angiogénese e a metastização, ao mesmo tempo que suprimem as respostas imunes e reduzem a eficácia da imunoterapia.

Aplicações de scRNA-seq em Biologia do Desenvolvimento

A scRNA-seq pode capturar os perfis de expressão génica das células em diferentes estágios de desenvolvimento, ajudando a construir trajetórias de desenvolvimento desde células estaminais até células especializadas e revelando redes de regulação génica durante o processo de desenvolvimento. Lars M. Steinmetz et al. realizaram uma análise de célula única de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) da medula óssea humana, mostrando que a aquisição de destinos específicos de linhagem é um processo contínuo.^[56]Durante o desenvolvimento embrionário, o scRNA-seq pode ser utilizado para rastrear destinos celulares e estudar como diferentes tecidos e órgãos se formam gradualmente durante o início do desenvolvimento. A equipa do Sanger Institute utilizou scRNA-seq de tecido tímico durante a fase embrionária para revelar o desenvolvimento do timo humano e o processo de maturação das células T. A sua pesquisa descobriu que as alterações correspondentes nas células estromais tímicas refletem tendências no desenvolvimento das células T.^[57].

Aplicações do scRNA-seq em Neurociência

O cérebro contém vários tipos de neurónios, cada um com diferenças em morfologia, função e expressão génica. A scRNA-seq pode identificar e classificar estes neurónios, revelando os seus distintos padrões de expressão génica.^[58]Além dos neurónios, o cérebro também contém um grande número de células gliais (como astrócitos, oligodendrócitos e microglia). A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) pode revelar as características de expressão genética dessas células não neuronais, ajudando a compreender os seus papéis no suporte, proteção e reparação neural. Elizabeth et al. realizaram uma análise de amostras corticais humanas com base na sequenciação de RNA de célula única e purificaram subpopulações viáveis de células microgliais dessas amostras, descobrindo que algumas subpopulações celulares estavam enriquecidas com genes e marcadores de RNA associados a doenças neurodegenerativas.^[59].

Resumo e Perspectivas

Em 2013, o scRNA-seq foi nomeado Tecnologia do Ano pela Nature Methods.^[60]e em 2018, a Science nomeou o scRNA-seq como a Tecnologia do Ano.^[61], cujo desenvolvimento rápido alargou significativamente a nossa compreensão da heterogeneidade celular e da função celular. O desenvolvimento rápido desta tecnologia expandiu enormemente a nossa compreensão da heterogeneidade e da função celular. Os instrumentos para sequenciação de células únicas estão a ser continuamente iterados e atualizados, enquanto o desenvolvimento de ferramentas de processamento de dados também está a progredir rapidamente, facilitando a aplicação generalizada desta tecnologia na biologia e na medicina. A scRNA-seq está a evoluir em direção a custos mais baixos, maior capacidade de processamento e capacidades multi-ômicas, e espera-se que tenha um uso ainda mais amplo nos campos da biologia e da farmacêutica no futuro.

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