Recuperação de DNA plasmidial de culturas bacterianas sem utilizar kits

Introdução

Muitas técnicas de biologia molecular, como sequenciação completa de DNA plasmidial, requerem DNA plasmídico altamente purificado e concentrado, e os plasmídeos bacterianos são amplamente utilizados como vetores de clonagem para recombinação de DNA. Após a construção de um novo plasmídeo, o seu tamanho e o espectro de endonucleases de restrição podem ser determinados por eletroforese em gel. Este artigo irá apresentar dois protocolos eficazes para extração de plasmídeos sem o uso de kits.

Protocolo A

Equipamento

• Microcentrífuga de secretária
• Vortexador de secretária

Reagentes

• Solução desnaturalizante
• Solução de renaturação
• etanol a 100% ou isopropanol
• etanol a 70%
• Tampão TE ou água

Protocolo

1. Cultivar uma cultura de bactérias durante a noite.

2. Centrifugue a cultura para precipitar as bactérias antes da preparação do DNA.

3. Remova o sobrenadante e ressuspenda as bactérias em tampão.

4. Adicione uma solução desnaturalizante às bactérias ressuspendidas para provocar a lise bacteriana e libertar o seu conteúdo.

5. Adicione uma solução de renaturação às bactérias desnaturadas para precipitar proteínas e DNA genómico, deixando os plasmídeos livres em solução.

6. Precipite a proteína e o DNA genómico por centrifugação e remova o sobrenadante que contém plasmídeos.

7. Adicione etanol ou isopropanol para precipitar o DNA plasmidial.

8. Precipite o DNA utilizando uma centrífuga ou aplique a solução a uma coluna que se ligará ao DNA.

9. Lave o pellet ou coluna com etanol a 70% para remover o excesso de sal.

10. Ressuspenda o pellet de DNA ou elua o DNA da coluna utilizando água ou um tampão neutro como o TE.

Protocolo B: o método de extração alcalina

Equipamento

• Túbulos de polipropileno do tipo Eppendorf (1,5 ml)
• Uma centrífuga de bancada capaz de gerar 8-10.000 xg

Reagentes

• Solução I: Solução de lisozima - 2 mg/ml de lisozima, 50 mM de glucose, 10 mM de CDTA, 25 mM de Tris-HCl (pH 8.0)
• Solução II: Solução alcalina de SDS - 0,2 N NaOH, 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS)
• Solução II: Solução salina elevada - 3 M de acetato de sódio (pH 4,8)
• 0,1 M acetato de sódio/0,05 M Tris-HCl (pH 8)
• Etanol frio

Protocolo

1. Cultivar uma cultura de bactérias durante a noite.

2. Transfira 0,5 ml de cultura para um tubo Eppendorf de 1,5 ml para extração de plasmídeo.

3. Centrifugue a cultura para sedimentar as bactérias antes de prosseguir com a preparação do DNA.

4. Remova o sobrenadante, adicione 100 µl da Solução I, ressuspenda o pellet celular e incube a 0 °C durante 30 min.

5. Adicione 200 µl da Solução II e gire suavemente. A suspensão deve tornar-se quase clara e ligeiramente viscosa. Mantenha o tubo a 0 °C durante 5 minutos.

6. Adicione 150 µl da Solução III e misture suavemente o conteúdo do tubo por inversão durante alguns segundos, durante os quais se formou um coágulo de ADN. O tubo é mantido a 0 °C durante 60 min.

7. Centrifugar durante 5 minutos, a 10.000 xg.

8. Remova o sobrenadante e transfira-o para um segundo tubo de centrífuga, adicione 1 ml de etanol frio e mantenha o tubo a -20°C durante 30 min.

9. Colete o precipitado por centrifugação durante 2 minutos.

10. Remova o sobrenadante e dissolva o pellet em 100 µl de acetato de sódio 0,1 M/Tris-HCl 0,05 M (pH 8) e reprecipite-o com 2 volumes de etanol frio, durante 10 min a -20℃.

11. Centrifugue durante 5 minutos, a 10.000 xg, e dissolva os pellets em 40 μl de água.

Na CD Genomics, nós fornecemos sequenciação completa de DNA plasmidial para ajudá-lo a investigar a evolução dos plasmídeos, a sua estrutura modular e a existência de pontos quentes para a inserção de genes acessórios.

Leituras Adicionais

Os Métodos para Extração e Purificação de DNA

Diretrizes para Submissão de Amostras de Sequenciamento de Alto Débito

Referência:

1. 1. Bimboim H C, Doly J. Um procedimento de extração alcalina rápida para triagem de DNA plasmídico recombinante. Pesquisa em Ácidos Nucleicos, 1979, 7(6):1513-1523.