Fluxo de Trabalho de Bioinformática de RNA-Seq

Sequenciação de RNA (RNA-seq) tem uma ampla gama de aplicações, e não existe um pipeline ótimo para todos os casos. Revisamos todos os principais passos na análise de dados de RNA-seq, incluindo controlo de qualidade, alinhamento de leituras, quantificação dos níveis de genes e transcritos, expressão diferencial de genes, perfilagem funcional e análise avançada. Serão discutidos mais adiante.

Figura 1. O fluxo de trabalho geral da análise de RNA-seq.

Controlo de qualidade das leituras brutas

O controlo de qualidade das leituras brutas de RNA-seq consiste na análise da qualidade da sequência, conteúdo de GC, conteúdo de adaptadores, k-mers sobre-representados e leituras duplicadas, dedicado à deteção de erros de sequenciação, contaminações e artefatos de PCR. A qualidade das leituras diminui em direção à extremidade 3’ das leituras, bases com baixa qualidade, portanto, devem ser removidas para melhorar a mapeabilidade. Além da qualidade dos dados brutos, o controlo de qualidade das leituras brutas também inclui a análise do alinhamento das leituras (uniformidade das leituras e conteúdo de GC), quantificação (viés 3’, biotipos e baixas contagens) e reprodutibilidade (correlação, análise de componentes principais e efeitos de lote).

Tabela 1. As ferramentas para o controlo de qualidade das leituras brutas de RNA-seq.

Alinhamento de leitura

Existem geralmente três estratégias para o alinhamento de leituras: mapeamento do genoma, mapeamento do transcriptoma, e de novo assembleiaIndependentemente de um genoma ou transcriptoma de referência estar disponível, as leituras podem mapear-se de forma única ou ser atribuídas a múltiplas posições na referência, que são referidas como leituras multi-mapeadas ou multileituras. As multileituras genómicas devem-se geralmente a sequências repetitivas ou domínios partilhados de genes parálagos. O mapeamento multi-transcriptómico surge mais frequentemente devido a isoformas de genes. Assim, a identificação e quantificação de transcritos são desafios importantes para genes expressos de forma alternativa. Quando uma referência não está disponível, as leituras de RNA-seq são montadas. de novo utilizando pacotes como SOAPdenovo-Trans, Oases, Trans-ABySS ou Trinity. Leituras específicas de fita PE e de longa duração são preferidas, uma vez que são mais informativas. Tecnologias emergentes de leitura longa, como Sequenciação SMRT da PacBio e Sequenciação por nanoporepode gerar transcrições completas para a maioria dos genes.

Figura 2. Três estratégias básicas para mapeamento de leituras de RNA-seq (Conesa) et al.. 2016). Abreviações: GFF, Formato de Características Gerais; GTF, formato de transferência de genes; RSEM, RNA-seq por Maximização da Expectativa.

Tabela 2. A comparação entre a genómica e de novo estratégias de montagem para análise de RNA-seq.

Tabela 3. As fontes públicas de dados de RNA-seq.

Quantificação de transcritos

A quantificação de transcritos pode ser utilizada para estimar os níveis de expressão de genes e transcritos.

Tabela 4. As ferramentas comuns para quantificação de transcritos.

Figura 3. As ferramentas para a quantificação da expressão de isoformas.

Teste de expressão diferencial

O teste de expressão diferencial é utilizado para avaliar se um gene está diferentemente expresso em uma condição em comparação com as outras. Métodos de normalização precisam ser adotados antes de comparar diferentes amostras. RPKM e TPM normalizam o fator mais importante, a profundidade de sequenciamento. TMM, DESeq e UpperQuartile podem ignorar características altamente variáveis e/ou altamente expressas. Outros fatores que interferem nas comparações intra-amostrais envolvem o comprimento do transcrito, viés posicional na cobertura, tamanho médio do fragmento e conteúdo de GC, que podem ser normalizados por ferramentas, como DESeq, edgeR, baySeq e NOISeq. Efeitos de lote podem ainda estar presentes após a normalização, os quais podem ser minimizados por um design experimental apropriado ou removidos por métodos como COMBAT ou ARSyN.

Tabela 5. Os ferramentas de normalização para teste de expressão diferencial.

Análise de splicing alternativo

A splicing alternativo (AS) é um processo pós-transcricional que gera diferentes transcritos a partir do mesmo gene e é vital em resposta a estímulos ambientais, produzindo produtos proteicos diversos. Várias ferramentas de bioinformática foram desenvolvidas para detectar AS a partir de dados experimentais. A comparação dessas ferramentas de deteção usando dados de RNA-seq foi realizada por Ding em 2017, e os resultados estão apresentados na Tabela 7. Demonstraram que o TopHat e a sua ferramenta subsequente, FineSplice, são as ferramentas mais rápidas, enquanto o PASTA é o programa mais lento. Além disso, o AltEventFinder pode detectar o maior número de junções, e o RSR detecta o menor número de junções. Outras ferramentas, como o TopHat, têm maior probabilidade de detectar falsos positivos. Das duas ferramentas que detectam isoformas diferencialmente splicadas, o rMATS é mais rápido que o rSeqDiff, mas detecta menos isoformas diferencialmente splicadas do que o rSeqDiff.

Tabela 7. Tipos de AS detectados ou isoformas diferencialmente splicing destas ferramentas (Ding et al.. 2017).

Visualização

Existem muitas ferramentas de bioinformática para a visualização de dados de RNA-seq, incluindo navegadores de genoma, como ReadXplorer, UCSC browser, Integrative Genomics Viewer (IGV), Genome Maps, Savant, ferramentas especificamente projetadas para dados de RNA-seq, como RNAseqViewer, bem como alguns pacotes para análise de expressão gênica diferencial que permitem a visualização, como DESeq2 e DEXseq no Bioconductor. Pacotes, como CummeRbund e Sashimi plots, também foram desenvolvidos para fins exclusivos de visualização.

Perfilagem Funcional

O último passo num estudo padrão de transcriptómica é geralmente a caracterização das funções moleculares ou vias nas quais os genes diferencialmente expressos estão envolvidos. A Gene Ontology, Bioconductor, DAVID ou Babelomics contêm dados de anotação para a maioria das espécies modelo, que podem ser utilizados para anotação funcional. Quanto a transcritos novos, os transcritos codificadores de proteínas podem ser anotados funcionalmente utilizando a ortologia com a ajuda de bases de dados como SwissProt, Pfam e InterPro. A Gene Ontology (GO) permite alguma intercambialidade de informação funcional entre ortólogos. O Blast2GO é uma ferramenta popular que permite a anotação massiva de um transcriptoma completo contra uma variedade de bases de dados e vocabulários controlados. A base de dados Rfam contém a maioria das famílias de RNA bem caracterizadas que podem ser utilizadas para a anotação funcional de RNAs longos não codificantes.

Análise avançada

A análise avançada de RNA-seq geralmente inclui outros RNA-seq e integração com outras tecnologias, como está delineado na Figura 4. Para mais informações sobre aplicações de RNA-seq, consulte este artigo. Aplicações de RNA-Seq.

Figura 3. A análise avançada de dados de RNA-seq.

Os nossos experientes cientistas de bioinformática são habilidosos na utilização de ferramentas avançadas de bioinformática para lidar com as numerosas sequências geradas pelo sequenciamento de nova e terceira geração. Oferecemos tanto sequenciamento como bioinformática serviços para genómica, transcriptómica, epigenómica, genómica microbiana, e Sequenciação SMRT da PacBio.

Referências:

1. Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, et al.Um inquérito sobre as melhores práticas para a análise de dados de RNA-seq. Biologia do genoma, 2016, 17(1): 13.
2. Ding L, Rath E, Bai Y. Comparação de Ferramentas de Detecção de Juncões de Splicing Alternativo Usando Dados de RNASeq. Genómica atual, 2017, 18(3): 268-277.
3. Grabherr M G, Haas B J, Yassour M, et al.Assemblagem de transcriptoma de comprimento completo a partir de dados de RNA-Seq sem um genoma de referência. Biotecnologia da Natureza, 2011, 29(7): 644.