Aplicações de RNA-Seq

O que é RNA-Seq?

A regulação da expressão génica é fundamental para ligar genótipos a fenótipos. As RNAs moldam redes complexas de expressão génica que impulsionam processos biológicos. Uma compreensão aprofundada dos mecanismos subjacentes sobre como governar essas redes complexas de expressão génica é vital para o tratamento de doenças complexas, como o câncer. Microarrays baseados em hibridização são utilizados para permitir o monitoramento simultâneo dos níveis de expressão de genes anotados em populações celulares. No entanto, abordagens em todo o genoma provaram fornecer insights mais valiosos sobre os transcriptomas. Estas plataformas de sequenciação de próxima/terceira geração permitem a geração rápida e rentável de grandes quantidades de dados de sequência. O perfilamento de RNA através da utilização de tecnologias de sequenciação de alto rendimento é conhecido como RNA-seq.

Vantagens do RNA-Seq

• Abrangência: A natureza abrangente de Sequenciação de RNA permite a deteção abrangente de todos os transcritos dentro da amostra, incluindo mRNAs codificadores de proteínas, RNAs não codificadores (como miARNs, lncARNs etc.) e isoformas de transcritos. Esta cobertura abrangente ajuda a obter uma compreensão mais completa da complexidade da regulação da expressão génica.
• Alta Sensibilidade: A alta sensibilidade de Sequenciação de RNA a tecnologia permite a deteção de moléculas de RNA em baixa abundância, possibilitando a descoberta de genes e transcritos de baixa expressão, bem como a deteção de variações de expressão mínimas. Consequentemente, isso permite uma visão mais holística do estado biológico das células ou tecidos.
• Quantificação: RNA-seq fornece insights quantitativos sobre os níveis de expressão génica, facilitando a medição precisa de quantidades manifestas de genes e transcritos distintos. Esta abordagem permite a análise comparativa, possibilitando a exploração de variações nas expressões génicas sob diferentes condições, bem como a quantificação das intensidades de regulação génica.
• Descoberta de Novos Genes e Transcritos: RNA-seq, agnóstico em relação ao conhecimento prévio, abre caminhos para descobrir novos genes e transcritos, abrangendo moléculas de RNA não anotadas ou de baixa abundância. Isso pode ajudar a desvendar novos genes funcionais e elementos regulatórios, expandindo a profundidade e a amplitude da pesquisa genómica.
• Deteção de Edição e Modificações de RNA: Sequenciação de RNA capacita a deteção de edição de RNA e modificações como splicing de RNA, edição de RNA e metilação de RNA, entre outras. Estes eventos de modificação de RNA têm impactos substanciais na função e regulação dos genes, assim, o sequenciamento de RNA pode revelar o dinamismo do RNA ao nível da modificação pós-transcricional.
• Análise de Célula Única: Técnicas de sequenciação de RNA de ponta são aplicáveis ao nível de célula única, permitindo a análise de perfis de expressão génica de células individuais. Esta abordagem oferece insights sobre as variações na expressão génica entre diferentes tipos de células e condições, além de revelar a funcionalidade e características de células individuais.
• Flexibilidade no Design Experimental: Sequenciação de RNA a tecnologia apresenta uma considerável flexibilidade no design experimental, atendendo a uma ampla gama de tipos de amostras e condições experimentais. Isso inclui diversas entidades biológicas, tecidos e tipos de células, bem como a análise da expressão génica sob várias condições de tratamento.

Aplicações de RNA-Seq

Desde RNA-seq é quantitativo, sendo útil para determinar os níveis de expressão de RNA. Além desta função básica, o RNA-seq pode ser utilizado para expressão diferencial de genes, deteção de variantes e expressão específica de alelos. perfilagem de RNA pequenocaracterização de padrões de splicing alternativo, biologia de sistemas, RNA-seq de célula única e desenvolvimento de SNPs e SSRs, etc.

RNA-SeqA tecnologia de sequenciação de alto rendimento permite a sequenciação abrangente de bibliotecas de cDNA de todos os RNAs transcritos dentro de uma amostra celular ou de tecido. Esta abordagem permite a avaliação quantitativa da expressão de RNA específico, contando os números de leitura correspondentes, ajudando na descoberta de novos transcritos. Desde que exista um genoma de referência, esses transcritos podem ser mapeados de volta ao genoma, melhorando a compreensão das informações genéticas abrangentes, como a localização do transcrito e os padrões de splicing. Esta técnica amplamente aplicada é integral a vários campos, incluindo investigação biológica, estudos médicos, investigação clínica e desenvolvimento farmacêutico, enriquecendo significativamente a nossa compreensão e aplicação das ciências genómicas.

Figura 1. Visão geral do pipeline típico de análise de RNA-seq (Han et al. 2015).

Expressão gênica diferencial

Uma aplicação importante de RNA-seq é a comparação de transcriptomas em diferentes estágios de desenvolvimento, tratamentos ou condições de doença. Esta análise, também conhecida como análise de expressão gênica diferencial, requer a identificação de genes juntamente com os seus isoformas e uma avaliação precisa dos seus níveis de expressão. É importante ilustrar elementos funcionais do genoma e descobrir os mecanismos biológicos do desenvolvimento e da doença.

As ferramentas comuns para a expressão diferencial de genes incluem Cuffdiff, DESeq, DESeq2, EdgeR, PoissonSeq, Limma voom e MISO.

Deteção de variantes e expressão específica de alelos

RNA-seq permite a identificação de variantes e expressão específica de alelos. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) referem-se à variação num único nucleotídeo que ocorre numa posição específica no genoma, o que pode levar à expressão específica de alelos (ASE). ASE significa que um dos dois alelos é altamente transcrito em mRNA e o outro é transcrito em baixa quantidade ou mesmo não é transcrito de todo. Estudos recentes também associaram ASE à suscetibilidade a várias doenças humanas. RNA-seq e sequenciação de ADN de genoma completo (WGS) permitir a identificação de variantes comuns de doenças, incluindo SNPs e ASE.

As ferramentas comuns utilizadas para a deteção de variantes são GATK, ANNOVAR, SNPiR, SNiPlay3.

Perfilagem de pequenos RNAs

RNA pequeno as espécies geralmente envolvem microRNA (miRNA), RNA pequeno interferente (siRNA) e RNA piwi-interagente (piRNA), bem como outros tipos de RNA pequeno, como RNA nucleolar pequeno (snoRNA) e RNA nuclear pequeno (snRNA). Os pequenos RNAs desempenham um papel no silenciamento gênico e na regulação pós-transcricional da expressão gênica. Foi demonstrado que os pequenos RNAs estão envolvidos em processos biológicos, incluindo desenvolvimento, proliferação e diferenciação celular, e apoptose. A maioria das investigações iniciais pequeno RNA estudos de descoberta utilizaram pirosequenciação e, posteriormente, outras plataformas de NGS com maior capacidade de processamento, o que resultou em inquéritos em todo o genoma e na descoberta de um número crescente de espécies de pequenos RNAs. Ferramentas bioinformáticas comuns para sequenciação de pequenos RNAs os dados estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Comparação de aplicações web de sRNA-seq (Rahman et al. 2018).

Caracterização de padrões de splicing alternativo

Os padrões de splicing alternativo são importantes para entender o desenvolvimento e as doenças humanas, uma vez que padrões de splicing alterados contribuem para o desenvolvimento, a diferenciação celular e as doenças humanas. RNA-seq é uma ferramenta poderosa para a caracterização de padrões de splicing alternativo. O sequenciamento de extremidades pareadas permite obter informações de sequência de ambas as extremidades, permitindo assim a deteção de padrões de splicing sem a necessidade de conhecimento prévio das anotações de transcritos. Sequenciação SMRT da PacBio permite a análise de padrões de splicing e conectividade de transcritos de uma forma imparcial e em escala genómica, gerando sequências de transcritos completos.

As ferramentas comuns para a caracterização de padrões de splicing alternativo incluem TopHat, MapSplice, SpliceMap, SplitSeek, GEM mapper, SpliceR, SplicingCompass, GIMMPS, MATS e rMATS.

Figura 2. RNA-seq para deteção de eventos de splicing alternativo (Ozsolak e Milos 2011).

Biologia de sistemas

Criar listas de genes de expressão diferencial (DE) não é o passo final de RNA-seq análise. Uma maior compreensão biológica de um sistema experimental pode ser obtida ao observar as alterações na expressão de conjuntos de genes. Este processo, conhecido como biologia de sistemas, baseia-se na compreensão de que o todo é maior do que a soma das partes. A análise de vias e a análise de redes de co-expressão são duas partes importantes incluídas.

Tabela 2. As ferramentas para análise de vias e análise de rede de co-expressão utilizando dados de RNA-seq.

RNA-seq de célula única

A sequenciação de RNA de célula única oferece oportunidades para dissecção da interação entre processos celulares intrínsecos e estímulos extrínsecos na determinação do destino celular. Contribui também para uma melhor compreensão de como uma 'célula fora do padrão' pode determinar o resultado de uma infeção. Além disso, a maioria das células vivas não pode ser cultivada in vitro, a sequenciação de RNA de célula única pode descobrir novas espécies ou processos regulatórios de relevância biotecnológica ou médica. O fluxo de trabalho da sequenciação de RNA de célula única envolve geralmente os seguintes passos: isolamento de célula única, construção de biblioteca de cDNA, RNA-seqe bioinformática (Figura 2).

Figura 3. O fluxo de trabalho geral do RNA-seq de célula única.

Aplicações de RNA-seq de célula única:

• Diferenciação de células estaminais
• Embriogénese
• Análise de tecido inteiro
• RNA-seq de célula única para estudos de organismo inteiro
• Biologia e tratamento de doenças

Desenvolvimento de SNPs e SSRs

RNA-seq é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizada para detetar e identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) dentro dos genomas. Ao comparar e analisar os dados transcriptómicos de diferentes indivíduos ou populações, podemos localizar as posições dos SNPs em vários genomas e, subsequentemente, realizar triagens e validações destes. Este processo ajuda a nossa compreensão da divergência genética entre organismos individuais, proporcionando uma base sólida para uma exploração mais aprofundada das relações entre genótipos e fenótipos. Além disso, o RNA-seq também pode ser utilizado para descobrir e analisar Repetições de Sequência Simples (SSRs) dentro da estrutura genómica. Os SSRs, que consistem em sequências de DNA repetidas encontradas no genoma, são fundamentais para a marcação genética e a pesquisa em genética populacional. Ao analisar os dados de sequência de RNA, podemos identificar genes e transcritos que contêm SSRs, estabelecendo assim uma base importante para estudos em diversidade genética e evolução.

Utilizando RNA-seq dados, somos capazes de construir um mapa genético do genoma -- revelando assim a distribuição dos loci genéticos e a extensão da diversidade genética. Através da análise de sequências de RNA de indivíduos ou populações distintas, não só conseguimos estabelecer uma ligação entre genótipo e fenótipo, mas também inferir a função dos SNPs e SSRs dentro do genoma, juntamente com a sua importância evolutiva. O RNA-seq também nos permite identificar e autenticar as diferenças genéticas entre diversos recursos de germoplasma e variedades. Ao analisar comparativamente os dados do transcriptoma de diferentes germoplasmas ou variedades, podemos descobrir SNPs e SSRs que apresentam características genotípicas ou fenotípicas específicas. Assim, isso estabelece uma base para a coleta, preservação e utilização de recursos de germoplasma.

Aplicação de RNA-Seq na Investigação do Cancro e de Outras Doenças

RNA-seq tem sido empregue em vários aspectos da investigação e terapia do câncer, abrangendo a descoberta e caracterização de biomarcadores que detalham a heterogeneidade e evolução do câncer, resistência a fármacos, microambientes imunes no câncer e imunoterapia, e neoantígenos. Notavelmente, as fusões genéticas têm estado inextricavelmente ligadas à tumorigenese e servem como biomarcadores ideais do câncer e alvos terapêuticos, predominantemente detetados através de RNA-CaptureSeq em amostras clínicas. Além dos biomarcadores de ácidos nucleicos, a integração de RNA-seq com imunohistoquímica e blotting de proteínas confirmou a identificação de certas proteínas como biomarcadores do câncer. Por exemplo, a combinação de COX nuclear₂ A cicloxigenase-2 (COX-2) e o HER2 (Receptor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano) emergiram como potenciais biomarcadores para o câncer, especificamente no diagnóstico do câncer colorretal e na previsão do seu prognóstico. RNA-seq pode detectar mutações em estágios iniciais e polimorfismos de alto risco, levando à descoberta de novos biomarcadores de câncer e potenciais alvos terapêuticos, monitorizando assim doenças e orientando a terapia direcionada em decisões de tratamento precoces. Por exemplo, no câncer da mama, a sequenciação de RNA de célula única revelou que células mieloides imaturas imunossupressoras infiltrantes do tumor contribuem para a resistência a medicamentos.

Figura 4. Aplicações do RNA-seq na análise de expressão diferencial e biomarcadores do câncer, heterogeneidade do câncer e resistência a fármacos, microambiente imunológico do câncer, imunoterapia e neoantígenos. (Hong et al., 2020)

Através da aplicação de Sequenciação de RNA (RNA-seq)Podemos contribuir para a revelação dos mecanismos subjacentes ao início da doença, melhorar a precisão no diagnóstico de doenças, avaliar a eficácia dos tratamentos e identificar novos alvos terapêuticos. Com uma análise comparativa de dados transcriptómicos de amostras de pacientes e grupos de controlo padrão utilizando RNA-seq, é possível discernir diferenças na expressão génica associadas ao início e à progressão da doença, revelando assim potenciais mecanismos da doença. Na identificação de biomarcadores relacionados a várias doenças, o papel do RNA-seq é vital. Ao examinar os dados de transcrição das amostras de pacientes, padrões específicos de expressão génica correlacionados com estados de doença podem ser descobertos. Esta revelação de novos biomarcadores tem implicações substanciais para diagnósticos precoces de doenças e avaliação prognóstica. Além disso, o RNA-seq pode ser utilizado para identificar novos alvos terapêuticos, orientar planos de tratamento personalizados e informar estratégias imunoterapêuticas. Para além da sua utilização na investigação do câncer, o RNA-seq tem encontrado amplas aplicações no estudo de várias outras doenças, incluindo afecções cardiovasculares, distúrbios neurológicos e doenças autoimunes. A análise e exame de dados transcriptómicos derivados de pacientes abrem caminho para uma compreensão mais profunda dos mecanismos da doença, que por sua vez fornecem novas perspetivas e estratégias para o diagnóstico e tratamento de doenças.

Aplicação do RNA-Seq na Biologia

Empregando RNA-Seqa tecnologia de sequenciação de alto rendimento, tem implicações substanciais em várias áreas biológicas. As aplicações do RNA-seq na biologia abrangem principalmente a análise da expressão génica, a investigação de RNA não codificante, estudos epigenéticos, pesquisa em evolução molecular e pesquisa em genómica funcional. Ao medir os níveis de expressão de mRNA a nível do transcriptoma, é possível identificar genes diferencialmente expressos sob diferentes condições, revelando redes regulatórias de genes e vias de sinalização. O RNA-seq pode facilitar a descoberta e análise de RNAs não codificantes, como miARNs e lncARNs, que desempenham papéis essenciais na regulação genética, epigenética e ocorrência de doenças. No que diz respeito à investigação da evolução molecular, os dados de RNA-Seq podem ser utilizados para comparar espectros de expressão génica entre diferentes espécies ou populações, investigando assim a evolução e diferenciação da função génica. Além disso, o RNA-seq serve para identificar e interpretar funcionalmente genes funcionais e elementos regulatórios dentro do genoma.

A utilização de dados de RNA-seq permite realizar uma investigação aprofundada sobre os mecanismos patogénicos microbianos. O RNA-seq permite-nos construir redes regulatórias transcricionais em micróbios e descobrir as relações entre fatores regulatórios e genes associados à patogenicidade. A identificação de genes que codificam fatores de virulência e mecanismos de evasão imunitária em micróbios contribui significativamente para a nossa compreensão da patogénese, uma vez que estes genes desempenham frequentemente papéis cruciais nas invasões microbianas e na circumvenção do sistema imunitário. Importante, o RNA-seq também pode facilitar a investigação sobre a resistência microbiana a antibióticos. Uma análise das alterações transcriptómicas microbianas após o tratamento com antibióticos pode esclarecer os genes e vias envolvidos no desenvolvimento da resistência. Além disso, esta tecnologia pode examinar as alterações na expressão génica em células hospedeiras durante o processo de infecção microbiana, o que pode revelar insights sobre os mecanismos de invasão microbiana, as respostas imunitárias do hospedeiro e as interacções moleculares envolvidas no processo patogénico.

Aplicação de RNA-Seq na Agricultura

RNA-Seq encontrou aplicações profundas na agricultura, particularmente no estudo de doenças em animais e plantas, na investigação da resistência e adaptabilidade das culturas, bem como no avanço do melhoramento molecular. Através da RNA-Seq, podemos avaliar as alterações na expressão génica em tecidos de animais e plantas infectados para identificar genes relacionados com a resistência a doenças. Além disso, a RNA-Seq permite a exploração de mudanças fisiológicas e metabólicas durante o início da doença, elucidando a sua fisiopatologia. A RNA-Seq pode ser instrumental na desvendar os mecanismos moleculares através dos quais as culturas contrapõem-se a stress ambientais. Ao investigar as alterações na expressão génica em culturas sob condições adversas, podemos identificar genes associados à resistência ao stress. Isso adiciona uma base teórica ao melhoramento seletivo de novas variações de culturas que estão adaptadas a diversas condições ambientais. Além disso, a RNA-Seq permite a análise da correlação entre dados extensivos de expressão génica e dados de características fenotípicas, facilitando assim estudos de associação genótipo-fenótipo. Isso é fundamental na identificação de genes funcionais associados a características alvo, fornecendo potenciais marcadores moleculares e informações sobre o background genético para o melhoramento molecular.

Os resultados de RNA-Seq A análise pode ser utilizada para desenvolver marcadores moleculares para uso na seleção assistida por marcadores (SAM) na melhoramento de culturas. Esta abordagem ajuda a aumentar a eficiência do melhoramento e a acelerar a seleção e disseminação de genes favoráveis. Além disso, o RNA-seq pode elucidar alterações na expressão gênica durante a interação entre plantas e microrganismos patogénicos ou pragas, contribuindo para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à resistência das plantas a doenças e pragas. Isto fornece alvos e estratégias novas para o manejo de doenças e pragas. O RNA-seq também é utilizado para investigar as redes regulatórias transcricionais envolvidas na interação entre plantas e microrganismos benéficos. Ajuda a identificar os efeitos promotores dos biofertilizantes no crescimento das plantas e na absorção de nutrientes, melhorando assim o rendimento e a qualidade das culturas.

Se quiser mais informações sobre RNA-seq, consulte os seguintes artigos:

Fluxo de trabalho de bioinformática de RNA-seq
As tecnologias e o fluxo de trabalho do RNA-seq

Referências:

1. Ozsolak F, Milos P M. Sequenciação de RNA: avanços, desafios e oportunidades. Nature Reviews Genetics, 2011, 12(2): 87.
2. Rahman R U, Gautam A, Bethune J, et al. Oasis 2: análise online melhorada de dados de sequenciação de pequenos RNAs. BMC bioinformática, 2018, 19(1): 54.
3. Han Y, Gao S, Muegge K, et al. Aplicações avançadas de sequenciação de RNA e desafios. Bioinformática e insights biológicos, 2015, 9: BBI. S28991.
4. Saliba A E, Westermann A J, Gorski S A, et al. RNA-seq de célula única: avanços e desafios futuros. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2014, 42(14): 8845-8860.
5. Hong M, Tao S, Zhang L, et al. Sequenciação de RNA: novas tecnologias e aplicações na investigação do cancro. JJornal de Hematologia e Oncologia, 2020, 13: 1-16.
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7. Simsek O, Donmez D, Kacar Y A. Análise de RNA-Seq na ciência da fruta: uma revisão. Am. J. Biol. das Plantas, 2017, 2(1): 2017020501.11.