Protocolo para Extração/Purificação de RNA Total

A aquisição de RNA de alta qualidade é o primeiro e crítico passo na realização de análises de RNA, incluindo PCR, transcrição reversa em tempo real (RT-qPCR), perfilamento da expressão génica com microarrays, Sequenciação de RNAe análise do norte, etc. A extração total de RNA (também conhecida como purificação de RNA) é o processo de extrair moléculas de RNA de amostras biológicas, como cultivo celular, tecido, FFPE, sangue. As questões mais importantes envolvidas no processo de purificação de RNA incluem a integridade do RNA, a pureza e a quantidade suficiente. O RNA de alta qualidade está livre de DNA genómico ou inibidores e não está degradado.

Em seguida, vamos introduzir um método manual de extração/purificação de RNA que é adequado para todos os tipos de tecidos da maioria das espécies de plantas e animais. O protocolo é ligeiramente variável entre os cientistas. Você também pode escolher kits disponíveis comercialmente que utilizam colunas de centrifugação ou esferas magnéticas. O RNA é muito instável, por isso todos os reagentes e materiais devem estar livres de RNase.

Materiais:

• Reagente TRIzol fresco: 40% p/p fenol, 1M tiocianato de guanidina, 1M tiocianato de amónio, tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH=5,0), 5% p/p glicerol
• Mistura de cloroformo e álcool isoamílico (24:1)
• 100% isopropanol
• etanol a 70%
• 10 M LiCl
• ddH livre de RNase fresco₂O ou autoclaved 1xTE

Equipamento e consumíveis

• Moinho de Mistura MM300
• Microcentrífuga de mesa
• Vortexador
• Pipetadores
• Túbulos de microcentrífuga

Congele um tubo microcentrífuga Eppendorf de 2ml com a amostra de tecido e uma bola de vidro a -80°C e, em seguida, triture a amostra no moinho MM300 a 30Hz durante dois minutos.

Adicione 1 ml de Reagente TRIzol fresco à amostra de tecido mecanicamente disposta, agite bem e incube a amostra à temperatura ambiente durante 5 minutos.

Adicione 0,2 ml de cloroformo ao tubo de microcentrífuga para homogeneização. Vortexe bem e incube a amostra à temperatura ambiente durante 3 minutos.

4. Centrifugar a amostra à velocidade máxima na microcentrífuga de mesa a 4°C durante 5 minutos.

5. Transfira a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 2 ml. Adicione um volume igual de clorofórmio ao novo tubo de microcentrífuga e agite bem. Centrifugue à velocidade máxima na microcentrífuga de bancada durante 5 minutos.

6. Transfira a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 2 ml. Adicione um volume igual de isopropanol ao novo tubo de microcentrífuga e agite bem. Centrifugue à velocidade máxima numa microcentrífuga de bancada a 4°C durante 10 minutos.

7. Lave o pellet com 1,5 ml de etanol a 70%. Gire à velocidade máxima na microcentrífuga de bancada durante 5 minutos.

8. Dissolva o pellet em 400 μl de 1xTE a 55°C, agitando bem com um vortex. Adicione um volume igual de 10 M de LiCl à solução e refrigere a -20°C durante várias horas (ou durante a noite).

9. Gire o tubo à velocidade máxima na microcentrífuga de mesa a 4°C durante 10 minutos. Remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante (contém ADN e RNA pequeno < 200 nt).

10. Lave o pellet com 1,5 ml de etanol a 70%, vortexe bem. Centrifugue o tubo à máxima velocidade numa microcentrífuga de bancada a 4°C durante 10 minutos. Descarte o etanol, não seque o pellet.

Dissolva o pellet em 200-400 μl de ddH livre de RNase fresco.₂O ou 1xTE.

Como verificar a qualidade do RNA?

A eletroforese pode ser utilizada para o controlo de qualidade do RNA, incluindo a quantidade e a integridade. Carregue 5 μl da solução em um gel de agarose padrão a 1,5 % com tampão 1xTHE. Adicione brometo de etídio (EB) ao gel. Carregue uma quantidade conhecida de DNA em uma pista adjacente para servir como padrão de concentração. O RNA intacto apresenta bandas nítidas de RNA ribossómico.

Leituras Adicionais:

Os Métodos para Extração e Purificação de DNA

Recuperação de DNA plasmídico de culturas bacterianas sem o uso de kits

Diretrizes para Submissão de Amostras de Sequenciamento de Alto Rendimento