Sequenciação de RNA Alvo

A sequenciação de RNA direcionada representa um serviço de ponta fornecido por prestadores de genómica proeminentes como a CD Genomics. Os investigadores que utilizam a sequenciação de RNA direcionada podem alcançar insights sem precedentes sobre genes de fusão, discernindo tanto eventos de fusão estabelecidos como aqueles anteriormente não reconhecidos, com um alto nível de detalhe. Essas capacidades são instrumentais em investigações oncológicas, facilitando abordagens terapêuticas personalizadas e aprofundando a nossa compreensão da patogénese do câncer.

A Introdução da Sequenciação de RNA Direcionada

A sequenciação de RNA direcionada seleciona e sequencia subconjuntos de transcritos de interesse, aumentando a cobertura de um conjunto focado de sequências de RNA. É um método preciso que gera informações genómicas e de expressão génica de regiões específicas do genoma. A análise das sequências de RNA específicas permite RNA-Seq com alta sensibilidade e acesso rentável a NGSAtravés de abordagens de enriquecimento por captura direcionada ou baseadas em amplicões, o Targeted RNA-Seq mede dezenas a milhares de alvos simultaneamente. Os ensaios de enriquecimento também são uma ferramenta para identificar tanto parceiros de fusão de genes conhecidos como novos em muitos tipos de amostras.

A sequenciação de RNA direcionada pode fornecer informações qualitativas e quantitativas para a análise de expressão diferencial, medição de expressão específica de alelos e verificação de fusões genéticas, ajudando a compreender a classificação e progressão dos tumores, doenças genéticas e a resposta a medicamentos baseados em RNA. A sequenciação do transcriptoma do câncer fornece informações valiosas sobre as alterações na expressão génica nos tumores. O perfilamento de biomarcadores de resposta a medicamentos baseados em RNA também ajuda a descobrir múltiplos caminhos tumorais suscetíveis a medicamentos e a melhorar a eficiência e taxa de sucesso do processo de desenvolvimento de medicamentos.

Vantagens da Sequenciação de RNA Direcionada

• Fornece uma análise abrangente das transcrições específicas.
• Escolha painéis validados específicos para vias, células ou doenças.
• Compatível com amostras de baixa qualidade, fixadas em formalina e incorporadas em parafina (FFPE)
• Prazo de entrega rápido e a mais alta qualidade de dados.
• Informação sobre transcritos de RNA
• Análise eficaz do transcriptoma e das vias metabólicas

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de RNA Direcionada

Oferecemos fluxos de trabalho integrados de RNA-Seq direcionado que simplificam todo o processo, desde a preparação da biblioteca até a análise de dados e interpretação biológica.

Especificações do Serviço

	Requisitos de Amostra A concentração recomendada deve ser de 20ug/L ou mais. É necessário um mínimo de 2g do total. O valor A260: A280 deve estar entre 1,8 e 2,0. O RNA deve ser armazenado em água livre de nucleases ou RNA Stable. O RNA deve ser validado utilizando um ensaio como um chip de RNA do BioAnalyzer. Valor de RIN ≥ 7.0 Tecido, célula, sangue e produtos sanguíneos são aceitáveis. Nota: As quantidades de amostra são listadas apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.
Clique	Estratégia de Sequenciação Illumina HiSeq PE50/75/100/150 >10G dados limpos Opções de serviço flexíveis: sequenciação de extremidade única ou pareada, número de leituras opcional de acordo com os objetivos da pesquisa.
	Análise Bioinformática Fornecemos múltiplas análises de bioinformática personalizadas: QC de dados brutos Alinhamento e quantificação baseada em TPM/RPKM/FPKM Análise de expressão gênica diferencial Estatísticas de SNPs/Indels Análise de splicing alternativo anotação GO e KEGG Nota: Os dados recomendados e os conteúdos de análise exibidos são apenas para referência. Para informações detalhadas, por favor contacte-nos com os seus pedidos personalizados.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes em Sequenciação de RNA Direcionada para a sua escrita (personalização)

Apoiado pela nossa equipa de cientistas experientes e tecnologia avançada, a CD Genomics oferece serviços de Sequenciamento de RNA Direcionado. Empregamos rigorosas medidas de controlo de qualidade e análises bioinformáticas avançadas para garantir resultados precisos e abrangentes. Se tiver requisitos ou questões específicas, não hesite em entrar em contacto connosco para mais assistência.

Resultados da Demonstração

Os resultados parciais estão mostrados abaixo:

Distribuição da qualidade de sequenciamento

Distribuição A/T/G/C

Interface do Navegador IGV

Análise de Correlação Entre Amostras

Gráfico de Pontuação PCA

Diagrama de Venn

Gráfico de Volcano

Resultados Estatísticos da Anotação GO

Classificação KEGG

Perguntas Frequentes sobre Sequenciação de RNA Direcionada

1. Como é que a sequenciação de RNA direcionada difere da sequenciação de RNA do transcriptoma completo tradicional?

Inteiro sequenciação do transcriptoma é um método relativamente imparcial para detectar transcritos de fusão, permitindo que os investigadores lancem uma rede ampla e capturem descobertas surpreendentes. No entanto, esta abordagem tem um custo: não só o sequenciamento do transcriptoma completo é caro, como muitas vezes tem uma sensibilidade inferior em comparação com métodos de sequenciamento direcionado.

A sequenciação de RNA direcionada, por outro lado, é distinta na medida em que não requer que os recursos de sequenciação sejam distribuídos por todo o transcriptoma, permitindo que os investigadores se concentrem em transcritos específicos para sequenciação profunda. Se bem concebidos, os métodos direcionados podem aumentar significativamente a sensibilidade de deteção enquanto identificam de forma fiável transcritos de fusão raros.

2. Quais são algumas aplicações do sequenciamento de RNA direcionado no desenvolvimento de fármacos e na investigação biológica?

A sequenciação de RNA direcionada é amplamente utilizada em áreas como investigação do câncer, neurociência, biologia vegetal, microbiologia e mais. As aplicações incluem a identificação de alvos para triagem de fármacos, o estudo de mecanismos de doenças e a análise dos efeitos do stress ambiental na expressão génica.

3. Como é que o sequenciamento de RNA direcionado melhora a capacidade de diagnóstico dos genes de fusão?

A sequenciação de RNA direcionada amplifica significativamente a capacidade de diagnóstico em relação aos genes de fusão, utilizando sondas oligonucleotídicas biotiniladas. Este método enriquece os transcritos de RNA, facilitando a identificação minuciosa de numerosos genes, nomeadamente aqueles que são esporádicos ou apresentam baixos níveis de expressão. Além disso, esta estratégia distingue habilmente genes de fusão reconhecidos, ao mesmo tempo que revela associações de genes de fusão até então não divulgadas.

Estudos de Caso em Sequenciação de RNA Direcionada

Diagnóstico de genes de fusão utilizando sequenciação de RNA direcionada

Revista: Comunicações da Natureza
Fator de impacto: 17,694
Publicado: 27 de março de 2019

Resumo

Os genes de fusão formados por rearranjos cromossómicos são críticos no câncer, contribuindo para cerca de 20% dos casos, com prevalência variável entre os tipos de câncer. A deteção rápida e precisa é crucial para um diagnóstico e tratamento adequados. Os métodos atuais, como FISH e RT-PCR, embora sensíveis, muitas vezes não conseguem identificar novos parceiros de fusão e rearranjos complexos, levando a diagnósticos errados em cânceres hematológicos. Sequenciação de RNA oferece uma vigilância abrangente, mas tem dificuldades com a sensibilidade para genes de fusão expressos em níveis baixos. A RNA-seq direcionada, utilizando sondas biotiniladas, melhora a deteção de transcritos raros e mostra potencial para diagnósticos precisos de genes de fusão em tumores sólidos e câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Resultados

A RNA-seq direcionada foi validada para o diagnóstico de genes de fusão em linhas celulares e amostras de tumores de pacientes. Identificou com sucesso genes de fusão conhecidos como ROS1 e ALK em biópsias de câncer de pulmão, determinando tanto os parceiros genéticos como as junções de fusão. Numa coorte clínica mais ampla de 72 amostras, incluindo tumores sólidos e malignidades hematológicas, a RNA-seq direcionada detetou genes de fusão em 76% dos casos, superando os métodos tradicionais. A reprodutibilidade foi alta entre amostras replicadas, demonstrando a sua fiabilidade para uso clínico. O método também revelou novos genes de fusão e isoformas, destacando o seu potencial para orientar o tratamento personalizado do câncer.

Fig 1. Identificação de fusões em amostras de coorte clínica.

A RNAseq direcionada não só identifica genes de fusão, mas também quantifica a expressão génica entre os genes capturados. Revela padrões de expressão distintos, como a alta expressão de genes de fusão como EZR-ROS1, e deteta casos em que fusões de promotores impulsionam alterações na expressão génica, como observado com ACSL3-ETV1. Apesar da sua sensibilidade, a RNAseq direcionada pode perder casos de fusões de promotores, como num exemplo de sarcoma com expressão elevada de ROS1. Além disso, fornece informações sobre a expressão de genes marcadores, como GATA2 em LMA e LMC, que correlacionam com o prognóstico.

Fig. 2. Diversidade da junção de fusão e expressão génica.

O painel sanguíneo dos autores visou os exões V, J e C nos loci dos receptores IG/TCR para identificar genes de fusão como IGH-MYC e IGH-BCL6 em pacientes com linfoma. Estas sondas também capturaram transcritos de RNA destes loci, permitindo o perfilamento do repertório imunitário. A análise de linhas celulares revelou clonótipos dominantes consistentes com populações clonais, enquanto as amostras dos pacientes mostraram clonótipos de receptores imunitários diversos, particularmente na maturação de células B na medula óssea, com expansões notáveis que podem indicar populações clonais malignas em alguns casos.

Fig. 3. Novas descobertas na análise transcriptómica.

Conclusão

Em resumo, as translocações cromossómicas que produzem genes de fusão são fundamentais no câncer, necessitando de um diagnóstico preciso para um tratamento eficaz. Ao contrário dos métodos tradicionais, o RNA-seq direcionado oferece uma deteção abrangente de genes de fusão conhecidos e novos em centenas de genes, facilitando um diagnóstico mais rápido e preciso. Apesar da sua capacidade de alto rendimento, o RNA-seq direcionado requer uma supervisão bioinformática meticulosa para mitigar falsos positivos. A sua capacidade de resolver rearranjos complexos e detectar isoformas alternativas melhora os insights prognósticos e o planeamento do tratamento, enquanto análises suplementares como o perfil de expressão génica e a clonotipagem de recetores imunes refinam ainda mais a precisão do diagnóstico. Em última análise, o RNA-seq direcionado está prestes a transformar o diagnóstico de genes de fusão, oferecendo uma utilidade clínica mais ampla e insights mais profundos sobre a biologia do câncer.

Referência

1. Heyer EE, Deveson IW, Wooi D, et al. Diagnóstico de genes de fusão utilizando sequenciação de RNA direcionada. Comunicações da Natureza2019, 27;10(1):1-2.