Sequenciação por Nanoporos para Detecção de Variações Estruturais, Tipagem HLA e Análise de STR

No campo da genética humana, a investigação baseada no sequenciamento de genoma completo serve como a base para capturar informações essenciais sobre variações genómicas, incluindo Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs), Inserções e Deleções (InDels), Variantes Estruturais (SVs), Variações no Número de Cópias (CNVs), entre outras. Estas variações genómicas são consideradas tarefas fundamentais e objetivos centrais na investigação científica. As tecnologias de sequenciamento de leituras longas, exemplificadas pelo Pacbio e Nanopore, com a sua característica distintiva de gerar leituras longas, demonstraram uma ampla utilidade no estudo de genomas humanos e não humanos.

O que é a Resequenciação por Nanoporos

A resequenciação por nanopore é uma técnica de sequenciação que envolve a realização de sequenciação do genoma completo em amostras humanas. Utilizando leituras longas que variam de 10kb a 20kb, estas sequências são alinhadas e analisadas em relação ao genoma de referência humano. Este processo permite a deteção precisa de variações genéticas, como Variações Estruturais (SVs) e Variações no Número de Cópias (CNVs), dentro das sequências de DNA das amostras comparadas ao genoma de referência ou entre diferentes amostras. Esta tecnologia aborda as limitações do re-sequenciamento de nova geração na deteção de variações de sequência de grandes segmentos.

Por que realizar re-sequenciação por nanopore

Através da exploração de SVs e CNVs, esta técnica encontra aplicações em análises diferenciais entre indivíduos ou populações. Desempenha um papel crucial em estudos relacionados a Antígeno Leucocitário Humano (HLA), Repetições em Tandem Curtas (STRs), e outros aspectos nos campos das doenças e cancros. O sequenciamento de terceira geração, com as suas vantagens de leituras longas (capazes de abranger grandes variações estruturais, regiões repetitivas, alto conteúdo de GC, regiões altamente homólogas e regiões altamente polimórficas) e a ausência de amplificação por PCR (evitando erros introduzidos pela amplificação por PCR), emergiu como uma nova estratégia para explorar a informação de variação genética no genoma humano.

Deteção de Variantes:

As Variações Estruturais Genómicas (SVs) referem-se tipicamente a variações estruturais de grandes segmentos que excedem 50bp, englobando vários tipos como deleções (DEL), inserções (INS), duplicações (DUP), inversões (INV) e variações no número de cópias (CNV). Estas variações, que ocorrem tanto a nível individual como populacional, impulsionam a diversidade e a evolução do genoma humano. Em comparação com os Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs), as SVs constituem uma proporção maior do total de variações e têm um impacto mais abrangente no genoma. Uma vez que ocorrem alterações, elas frequentemente exercem efeitos profundos nos organismos vivos. Evidências crescentes indicam a associação das SVs com numerosas doenças humanas, incluindo distúrbios neurodesenvolvimentais, doenças cardiovasculares e cancros. Portanto, uma análise sistemática das SVs no genoma humano tem implicações significativas tanto para a pesquisa biológica como clínica.

No entanto, a deteção de SVs continua a ser um desafio tecnológico notavelmente complicado. Em primeiro lugar, os SVs em si abrangem uma variedade diversificada de tipos, normalmente classificados em cinco categorias: inserções, deleções, duplicações, translocações e inversões. A natureza distinta destas cinco mutações introduz variações notáveis nas complexidades de deteção. Por exemplo, as mutações de deleção são relativamente mais fáceis de detectar, enquanto a identificação de mutações de inserção ou duplicação apresenta maiores desafios. Em seguida, certas mutações SV exibem magnitudes substanciais, definidas como superiores a 50 pares de bases, com algumas a estender-se a várias centenas de quilobases. Para segmentos curtos típicos de sequenciação de nova geração, isto representa um desafio inegável que as abordagens tecnológicas atuais lutam para superar. Além disso, sequências repetitivas como os CNVs apresentam dificuldades adicionais devido ao comprimento limitado dos dados de sequenciação, tornando-as igualmente desafiadoras de abordar.

Utilizando leituras longas Sequenciação por nanoporo A tecnologia elimina a necessidade de emenda, permitindo uma cobertura abrangente da variação estrutural e/ou regiões repetitivas, tudo enquanto retém informações relativas à poliploidia. Além disso, ao analisar as sequências de ambas as fontes parentais, torna-se viável discernir com precisão a ocorrência de variações estruturais (SVs). Isso, por sua vez, fornece dados mais precisos e refinados para investigar o papel das variações estruturais em doenças, evolução e diversidade genética. Assim, atualmente, a utilização de fragmentos longos de nanoporo destaca-se como a estratégia ideal para a deteção de variações estruturais.

Análise de STRs:

Os Repetidos em Tandem Curtos (STRs) são sequências de DNA breves, tipicamente compostas por 2 a 6 pares de bases (pb), presentes de forma repetitiva em posições fixas no genoma. Os STRs constituem aproximadamente 7% da sequência do genoma humano e exibem alta polimorfismo, com variações de comprimento observadas entre diferentes indivíduos. Alelos anormalmente alongados ou "expandidos" de STRs representam uma categoria significativa de variações patogénicas dentro das populações. Até à data, expansões de STRs em mais de 40 genes foram estabelecidas como causadoras de doenças hereditárias. A maioria destas condições manifesta-se principalmente com sintomas neurológicos ou neuromusculares, abrangendo distúrbios como a doença de Huntington (HD; HTT), a Síndrome do X Frágil (FXS; FMR1), ataxias hereditárias (RFC1, FXN, etc.), distrofia miotónica (DMPK e CNBP), canalopatias musculares (CSTB, SAMD12, STARD7, etc.), bem como a demência frontotemporal relacionada com C9orf72 e esclerose lateral amiotrófica (ELA).

Dada a (i) natureza diversa e prevalente dos distúrbios de expansão de Repetições em Tandem Curtas (STR), (ii) a multitude de genes envolvidos, (iii) a descoberta contínua de novos genes, (iv) a diversidade em tamanho e conformação de sequência das expansões patogénicas de STR, e (v) as lacunas existentes na nossa compreensão fundamental da sua biologia, há uma crescente demanda por métodos de deteção molecular aprimorados para STRs. As técnicas moleculares estabelecidas (como o Southern blotting e a Reação em Cadeia da Polimerase com Primers de Repetição, RP-PCR) são relativamente lentas, trabalhosas, imprecisas e requerem ensaios individuais com primers/probes específicos para cada STR distinto.

Isto torna-se problemático quando múltiplas expansões de STR diferentes podem manifestar fenótipos semelhantes (heterogeneidade de locus), representando um grande obstáculo à testagem de genes de STR recém-descobertos. O sequenciamento de nova geração (NGS) tem utilidade na análise de expansões de STR. No entanto, o grande tamanho, a baixa complexidade de sequência e o alto conteúdo de GC de muitas expansões de STR patogénicas tornam-nas desafiadoras de analisar através de plataformas de NGS de leituras curtas (como a Illumina). Portanto, há uma necessidade crescente de metodologias refinadas na deteção molecular de STRs.

Sequenciação por nanopore e Sequenciação do Pacífico, ambos abrangendo sequenciação de leitura longa As tecnologias são aplicáveis para a tipagem genética de grandes e intrincidas expansões de STR. Estas metodologias facilitam uma cobertura contínua de regiões de baixa complexidade dentro do genoma, isentas de viés de GC. Outra vantagem destas tecnologias reside na análise simultânea da metilação de DNA em locais repetitivos. Assim, a utilização de dados de leitura longa de terceira geração para a deteção de STR apresenta vantagens distintas.

Locais de STR patogénicos com ONT

Tipagem HLA:

O Antígeno Leucocitário Humano (HLA), localizado no braço curto do cromossoma 6 no genoma humano, compreende uma série de loci genéticos intimamente ligados. Classificado em três categorias principais—Ⅰ, Ⅱ e Ⅲ—o HLA é principalmente distinguido com base nas características estruturais, funcionais e de distribuição celular dos seus produtos gênicos. A tipagem dos genes das classes Ⅰ e Ⅱ tem uma relevância significativa em aplicações clínicas.

A HLA apresenta uma característica de elevado polimorfismo, pelo qual as células imunes distinguem o próprio do não próprio ao reconhecerem a HLA, tornando-a o "bilhete de identidade" genético dos humanos. Estreitamente interligada com o sistema imunitário do corpo, a tipagem de HLA encontra as suas principais aplicações em áreas como a medicina de transplantes, a investigação de doenças relacionadas com o sistema imunitário, as respostas a medicamentos e as transfusões de plaquetas. Dada a natureza desafiadora da tipagem precisa devido às suas características polimórficas, a caracterização precisa dos genes HLA tem consistentemente representado um enigma de investigação e uma direção fervorosamente perseguida por várias tecnologias de sequenciação.

Nos últimos anos, as tecnologias de sequenciação de alto rendimento, aproveitando as suas vantagens em termos de rendimento, caracterização genómica abrangente ou completa, tempos de resposta mais curtos e redução da ambiguidade na determinação de sequências, suplantaram a sequenciação de Sanger como o padrão-ouro para a tipagem de alta resolução do Antígeno Leucocitário Humano (HLA). Esta transição apresenta uma vantagem significativa em relação aos métodos de tipagem convencionais.

O Sequenciação por nanoporo a plataforma demonstrou um desempenho excecional na geração de leituras longas (milhares ou milhões de pares de bases). Ao empregar a estratégia "amplicão longo, leitura longa", consegue eliminar a necessidade de fragmentação de DNA durante a preparação de bibliotecas de sequenciação HLA. Simultaneamente, otimiza a identificação de variações distantes que abrangem milhares de pares de bases. Esta plataforma alcança uma consistência e precisão excecionais, sendo amplamente considerada uma solução rápida e económica para tipagem HLA.

Comparação de fluxos de trabalho entre NGS tradicional e sequenciação por nanopore.

Referências:

1. Chang Liu a., Xiao Yang b,1, Brian F Duffye, Jessica Hoisington-Lopezd, Maria Lynn Crosby, Rhonda Porche-Sorbet, Katsuyuki Saito e, Rick Berry, Victoria Swamidass', Robi D. Tipagem HLA de alta resolução por leituras longas a partir das células de fluxo Oxford Nanopore R10.3. Mitra Imunologia Humana 2021
2. Igor Stevanovski et al., Diagnóstico genético abrangente de distúrbios de expansão de repetições em tandem com sequenciação nanopore direcionada programável. Sci. Adv..8,eabm5386(2022).
3. Liu C. Um longo caminho/leitura para a tipagem HLA de alta resolução rápida: A perspetiva do nanopore. Hum Immunol. Jul 2021;82(7):488-495.