Introdução aos Microssatélites e Genotipagem de Microssatélites

O que são microssatélites?

Microssatélites, também conhecidos como repetições em tandem curtas (STRs) ou repetições de sequência simples (SSRs), são sequências repetitivas em tandem nas quais a unidade repetitiva contém de um a seis nucleotídeos. O número de repetições é muito variável nas populações e dentro dos alelos de um indivíduo, uma vez que os microssatélites são propensos a deslizes durante a replicação do DNA. Apesar da instabilidade dos microssatélites ocorrer em todas as células em divisão, os microssatélites permanecem estáveis em comprimento devido ao sistema MMR, que desempenha um papel importante na reparação de erros de replicação do DNA e na regulação de eventos de recombinação.

Microssatélites: marcadores genéticos informativos

Os microssatélites são marcadores genéticos importantes porque tendem a ser altamente polimórficos e têm sido utilizados como marcadores específicos de sexo, marcadores específicos de população, etc. Com o advento da PCR, os polimorfismos de marcadores de microssatélites substituíram os RFLPs como marcadores para a construção de mapas de ligação. As regiões flanqueadoras são críticas, pois permitem que os pesquisadores projetem primers específicos de lócus para amplificar os microssatélites via PCR. Ou seja, os primers para PCR são as sequências das regiões flanqueadoras únicas. Ao desenvolver um primer direto e um reverso em ambos os lados do microssatélite, conseguimos amplificar uma região de microssatélite específica de lócus para determinar a variação do microssatélite.

Vantagens dos microssatélites como marcadores genéticos:

• Altamente polimórficos. A razão parece ser o deslize na replicação.
• Específicos de lócus. Primers específicos de lócus permitem-nos amplificar microssatélites específicos de lócus.
• Codominantes (em contraste com RAPDs e AFLPs que são "binários, 0/1").
• Baseados em PCR. Trabalhamos com pequenas quantidades de DNA com instrumentos laboratoriais baratos.
• Uma variedade de escalas, desde identificação individual até filogenias de alta resolução

Aplicações de marcadores de microssatélites

Os marcadores de microssatélites são muito úteis (i) em estudos de diversidade biológica medidos com base na distância genética; (ii) para estimar fluxo gênico e taxas de recombinação; (iii) para inferir relações genéticas infraespecíficas; (iv) para construir mapas de ligação e definir impressões digitais de DNA de cultivares; (v) para mapear lócus envolvidos em características quantitativas; (vi) para determinar o grau de parentesco; (vii) em melhoramento utilizando seleção assistida por marcadores. Ou seja, esses marcadores são especialmente úteis em estudos de estrutura populacional, mapeamento genético e evolução.

Figura 1. Etapas do fluxo de trabalho do desenvolvimento de marcadores SSR (microssatélites).

Genotipagem de microssatélites

Genotipagem é o processo de identificar o genótipo de cada microssatélite. O fluxo de trabalho da genotipagem de microssatélites geralmente envolve o design de primers específicos, amplificação de microssatélites e teste de polimorfismo.

• Design de primers específicos

Se alguém desenvolveu primers SSR para uma espécie estreitamente relacionada, esses primers valerão a pena serem verificados na sua espécie. Se, no entanto, não houver primers desenvolvidos para espécies relacionadas, você pode precisar projetar os seus próprios. É necessário ter as sequências de nucleotídeos primeiro, seja do seu próprio projeto de sequenciamento ou do banco de dados de nucleotídeos NCBI. Os motivos SSR podem ser identificados usando a ferramenta de identificação de microssatélites (MISA) (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa). Primers SSR específicos de lócus podem ser projetados com o SSRLocator v1.0.

• Amplificação de microssatélites

Uma vez que os primers SSR tenham sido desenvolvidos, é necessário validar esses primers usando amplificação por PCR. Cada mistura de reação SSR-PCR de 20 uL consiste em DNA polimerase, 1× tampão de reação, 2 mmol L^-1 MgCl2, 40 umol L^-1 mistura de dNTP, 0.5 umol L^-1 primer direto, 0.5 umol L^-1 primer reverso e 50 ng de DNA genômico. O ciclo térmico é realizado em um instrumento de PCR sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 5 min, 36 ciclos de desnaturação a 94°C por 50s, anelamento a temperatura ótima por 1 min e extensão a 72°C por 1 min, além de uma extensão final a 72°C por 7 min.

• Teste de polimorfismo

Os resultados da PCR podem ser visualizados por eletroforese em gel de agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). A genotipagem por PAGE é trabalhosa, mas fornece boa resolução. Para estudos de alta resolução, primers SSR marcados podem ser sintetizados com um corante fluorescente para genotipagem por eletroforese capilar usando instrumentos como o ABI 3730 DNA Analyzer. Nesse caso, cada produto de PCR é carregado em um capilar contendo uma matriz de poliacrilamida na qual a eletroforese é realizada. A fluorescência emitida é capturada e a massa molecular do produto de PCR é determinada. Um eletroferograma é então gerado, mostrando picos de luminescência correspondentes a cada alelo amplificado.

Referências:

1. Vieira M L C, Santini L, Diniz A L, et al. Marcadores de microssatélites: o que significam e por que são tão úteis. Genética e biologia molecular, 2016, 39(3): 312-328.
2. Saha D, Rana R S, Chakraborty S, et al. Desenvolvimento de um conjunto de marcadores SSR para detecção de polimorfismo genético e melhoramento de juta híbrida interespecífica. The Crop Journal, 2017, 5(5): 416-429.
3. Guichoux E, Lagache L, Wagner S, et al. Tendências atuais na genotipagem de microssatélites. Recursos de ecologia molecular, 2011, 11(4): 591-611.