Tipagem HLA: Introdução, Métodos e Aplicações

Introdução à Tipagem de Antígenos Leucocitários Humanos

As proteínas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) dos humanos são codificadas pelo sistema HLA (antígeno leucocitário humano). O sistema imunitário humano é regulado por estas glicoproteínas que fazem parte da membrana celular. O MHC é dividido em duas classes: MHC classe I e MHC classe II. O complexo génico HLA encontra-se no cromossoma 6p21 numa região de 3,6 Mb. Com mais de 10.000 alelos HLA diferentes identificados até à data, eles são a família de genes mais polimórfica no genoma humano. Como resultado, a capacidade de montar uma resposta imunitária pode variar significativamente entre indivíduos dentro de uma coorte retirada de uma única população. A rejeição de transplantes, doenças autoimunes, farmacogenómica de vacinas, câncer, doenças infecciosas e seleção de parceiros têm todos sido associados a genes HLA.

Genotipagem HLA é o processo de determinação dos polimorfismos dos genes HLA classe I e classe II de um indivíduo, que é necessário para a compatibilidade em transplantes e investigação de associações a doenças. Devido ao elevado polimorfismo em várias regiões genómicas, a genotipagem HLA inequívoca é tecnicamente desafiadora. A introdução do sequenciamento de nova geração (NGS) alterou o panorama da genotipagem. Os métodos tradicionais de genotipagem HLA e os ensaios de sequenciamento Sanger têm limitações, e a genotipagem HLA de alta resolução utilizando PCR e NGS é distintivamente capaz de reconhecer essas limitações em pacientes. Permite uma análise fiável, simples, de alta qualidade e de elevado rendimento dos principais genes HLA, com dados agrupados em pelo menos seis dígitos. Outro benefício é que, uma vez que as estruturas de ADN são compostas por moléculas únicas, o problema do agrupamento é resolvido.

Deteção de Anticorpos HLA e Suas Aplicações

Anticorpos contra HLA foram descobertos em cerca de 20% das mulheres multíparas e em 30% a 50% dos pacientes multi-transfundidos. O método tradicional de citotoxicidade serológica, a citometria de fluxo e o método em fase sólida são as três principais abordagens para detectar anticorpos HLA.

Método de citotoxicidade serológica

As esferas magnéticas são utilizadas para segregar linfócitos B do sangue ou baço para tipagem de HLA classe II. A tipagem de HLA classe I pode ser feita com os leucócitos restantes. Os linfócitos são então colocados em poços individuais em placas de Terasaki, que consistem em vários anticorpos específicos. As células nesse poço morrerão se o anticorpo específico e o antígeno HLA se ligarem. Este método não consegue distinguir entre anticorpos citotóxicos de HLA e não-HLA.

Citometria de fluxo

Leucócitos recém-nucleados são misturados com anticorpos monoclonais marcados com fluorescência neste experimento. Os antígenos HLA de superfície que se ligam aos anticorpos fluorescem, permitindo que os citómetros de fluxo os detetem à medida que passam por um feixe de laser.

Técnica de fase sólida

A reação é estabelecida utilizando anticorpos específicos de FC conjugados com PE após esferas de poliestireno tingidas com fluorocromos, revestidas com antígenos HLA particulares, serem cultivadas com o soro do paciente. Embora esta técnica seja mais delicada do que a citotoxicidade sorológica e o ELISA, o efeito terapêutico do aumento da sensibilidade ainda não foi determinado.

Deteção do Polimorfismo HLA e o Seu Fluxo de Trabalho

Os métodos baseados em DNA dominaram os laboratórios de tipagem desde o avanço da reação em cadeia da polimerase (PCR), devido à sua precisão e reprodutibilidade, bem como ao aumento da sensibilidade e resolução. Primers específicos de sequência de PCR (SSP), oligonucleotídeos específicos de sequência de PCR (SSO), PCR em tempo real, tipagem baseada em sequenciamento (SBT) e sequenciamento de nova geração (NGS) são todos métodos baseados em DNA.

Devido à sua precisão, elevada capacidade de processamento e rapidez, a NGS, também conhecida como sequenciação de alto rendimento, está a tornar-se gradualmente o método preferido para tipagem de HLA. O benefício mais significativo da NGS é que elimina ambiguidades a um custo comparável ao SBT e sem a necessidade de triagens adicionais. A preparação da biblioteca de DNA, a amplificação direcionada de genes que codificam para péptidos HLA utilizando PCR em emulsão ou em fase sólida, a tipagem baseada em sequenciação de DNA e o alinhamento de sequências contra bases de dados de genes, como a base de dados do projeto internacional ImMunoGeneTics/human leukocyte antigen (IMGT/HLA), fazem parte do processo de NGS. A tipagem de HLA baseada em sequenciação de alto rendimento é comumente utilizada no diagnóstico clínico, tratamento e medicina personalizada.

Referências:

1. Duque JL, Lind C, Mackiewicz K, et al.Determinação das características de desempenho de um método de tipagem HLA baseado em NGS para aplicações clínicas. Olá2016, 87(3).
2. Carapito R, Radosavljevic M, Bahram S. Sequenciação de próxima geração do locus HLA: métodos e impactos na tipagem HLA, genética populacional e estudos de associação com doenças. Imunologia humana2016, 77(11).
3. Gabriel C, Fürst D, Faé I, et al.Tipagem HLA por sequenciação de nova geração – a chegar mais perto da realidade. Antígenos teciduais2014, 83(2).