Uma Visão Geral da Tipagem HLA

O que é HLA?

Os Antígenos Leucocitários Humanos (HLAs) são a versão humana do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). O MHC é um conjunto de proteínas de superfície celular essenciais para o sistema imunitário adquirido reconhecer moléculas exógenas em vertebrados, o que determina a histocompatibilidade. Os HLAs estão presentes em todas as células nucleadas do corpo. Cada indivíduo possui um conjunto único de HLAs, metade derivada de cada progenitor.

Figura 1. Mapa genético da região do antígeno leucocitário humano (HLA) (Berlingerio) et al.. 2009).

O HLA consiste em mais de 200 genes no cromossoma 6 e é categorizado em três grupos principais: HLA classe I, HLA classe II e HLA classe III. Os genes da HLA classe I, incluindo HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G, produzem proteínas que estão ligadas a peptídeos na superfície celular de quase todas as células. A HLA classe I pode reconhecer moléculas estrangeiras e desencadear a autodestruição da célula infectada. Os genes da HLA classe II, incluindo HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA e HLA-DOB, produzem proteínas que estão presentes quase exclusivamente na superfície de certas células do sistema imunitário. Tanto as proteínas da MHC classe I quanto da classe II exibem peptídeos ao sistema imunitário. No entanto, as proteínas produzidas a partir dos genes da MHC classe III funcionam de maneira um pouco diferente. Elas estão provavelmente envolvidas na atividade do sistema imunitário, como a inflamação. E alguns genes HLA têm funções desconhecidas.

A significância clínica do HLA

Os genes HLA têm muitas variações. Por exemplo, o HLA-B27 tem centenas de alelos identificados. O seu elevado grau de polimorfismo permite que o sistema imunitário do indivíduo responda a uma ampla gama de invasores estrangeiros, e versões específicas podem estar associadas a doenças humanas.

• HLA e doença

Mais de 100 doenças foram relatadas como estando ligadas a diferentes alelos dos genes HLA. Muitas doenças, como espondilite anquilosante, doenças hepáticas, função imunitária anormal e alguns tipos de câncer, foram associadas a alelos HLA específicos.

• Sistema HLA no tratamento clínico

O sucesso do transplante ou transfusão de células ou tecidos está fortemente associado aos sistemas HLA do par dador-recipiente. Quando as moléculas de superfície celular dos dadores são diferentes daquelas presentes no recetor, os antígenos do sistema HLA provocam respostas imunes fortes, uma vez que podem ser reconhecidos direta ou indiretamente pelo sistema imunitário (Figura 2). O caminho direto envolve o reconhecimento direto das moléculas HLA presentes nas células apresentadoras de antígenos (APCs) do dador e a ativação de células T imunologicamente naïve. O caminho indireto envolve o processamento e a apresentação de peptídeos HLA derivados do dador pelas APCs do hospedeiro, que opera de forma mais eficiente em indivíduos que possuem células T de memória.

Figura 2. Alorecognição (Brown e Navarrete 2011).

Tipagem HLA

Uma vez que o sistema HLA tem sido implicado na rejeição de células e tecidos estrangeiros, Tipagem HLA torna-se importante em instalações clínicas, o que permite prever a resposta imune após transplante ou transfusão. Além disso, a tipagem HLA também é utilizada como uma forma de diagnóstico clínico para identificar marcadores de doenças específicas, como a espondilite anquilosante. Existem dois métodos principais para a tipagem HLA, ou seja, a deteção de anticorpos HLA e a deteção de polimorfismos HLA.

Figura 3. Representação esquemática do ensaio de deteção de anticorpos anti-HLA utilizando a tecnologia Luminex e as diferentes abordagens baseadas em ADN para tipagem de HLA (Picascia) et al.. 2016).

• Deteção de anticorpos HLA

Anticorpos HLA foram encontrados em cerca de 20% das mulheres multiparas e em 30-50% dos pacientes multi-transfundidos. Existem três métodos principais para a deteção de anticorpos HLA, incluindo o método convencional de citotoxicidade serológica, citometria de fluxo e técnica de fase sólida.

• Método de citotoxicidade serológica

Neste método, são utilizadas esferas magnéticas para isolar linfócitos B para tipagem de HLA classe II a partir de sangue ou baço. Os leucócitos restantes podem ser utilizados para tipagem de HLA classe I. Os linfócitos são então adicionados a placas de Terasaki que contêm poços individuais com vários anticorpos específicos. Se o anticorpo específico e o antígeno HLA se ligarem, as células naquele poço estarão mortas. Este método não consegue diferenciar anticorpos citotóxicos de HLA e não-HLA.

• Citometria de fluxo

Aqui, leucócitos nucleados frescos são adicionados a anticorpos monoclonais marcados com uma molécula fluorescente. As células com antígenos HLA de superfície que se ligam ao anticorpo fluorescem, o que pode ser detetado por um citómetro de fluxo à medida que passam através de um feixe de laser.

• Técnica de fase sólida

Esferas de poliestireno tingidas com fluorocromos e revestidas com antígenos HLA específicos são incubadas com o soro do paciente, e a reação é desenvolvida utilizando anticorpos específicos conjugados com PE. Este método é mais sensível do que o método de citotoxicidade sorológica e o ELISA, mas o benefício clínico do aumento da sensibilidade ainda não está claramente definido.

• Deteção de polimorfismo HLA

Com o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR), as técnicas baseadas em DNA dominaram os laboratórios de tipagem devido à sua precisão e reprodutibilidade, bem como à sensibilidade e resolução aprimoradas. As técnicas baseadas em DNA incluem primers específicos de sequência para PCR (SSP), oligonucleotídeos específicos de sequência para PCR (SSO), PCR em tempo real, tipagem baseada em sequenciamento (SBT) e sequenciamento de nova geração (NGS).

O NGS, também conhecido como sequenciação de alto rendimento, torna-se gradualmente o método preferido para tipagem de HLA devido à sua precisão, alto rendimento e rapidez. A maior vantagem do NGS é a eliminação de ambiguidades com custos comparáveis ao SBT, e sem a necessidade de testes adicionais. O processo de NGS envolve a isolação de DNA a partir de células e amplificação, preparação da biblioteca de DNA, amplificação direcionada de genes que codificam os peptídeos HLA usando PCR em emulsão ou em fase sólida, tipagem baseada em sequenciação de DNA e alinhamento de sequências contra bancos de dados de genes, como o projeto internacional ImMunoGeneTics / banco de dados de antígenos leucocitários humanos (IMGT/HLA). A tipagem de HLA baseada em sequenciação de alto rendimento tem sido amplamente utilizada no diagnóstico clínico, tratamento e medicina personalizada.

Figura 4. Processo de NGS para tipagem de HLA.

Tabela 1. Software de tipagem HLA por NGS (adaptado de 4. Hosomichi) et al.. 2015).

Na CD Genomics, estamos dedicados a fornecer soluções fiáveis. Tipagem HLA análise bioinformática profissional e de serviços. Além disso, também oferecemos serviços que incluem Sequenciação de mutações CRISPR, sequenciação de rastreio de anticorpos, e sequenciação do repertório imunitário, para apoiar o desenvolvimento de medicamentos e o tratamento clínico. Sinta-se à vontade para contactar o nosso cientista para especificações detalhadas dos serviços.

Referências:

1. Berlingerio, Michele, et al."Mineração de dados clínicos, imunológicos e genéticos de transplante de órgãos sólidos." Dados Biomédicos e Aplicações. Springer, Berlim, Heidelberg, 2009, 211-236.
2. Brown C J, Navarrete C V. Relevância clínica do sistema HLA na transfusão de sangue. Voz do sangue, 2011, 101(2): 93-105.
3. Berger. Tipagem HLA. BMJ2001 Jan 27:322(7280):218.
4. Hosomichi K, Shiina T, Tajima A, et al.O impacto das tecnologias de sequenciação de próxima geração na investigação do HLA. Revista de Genética Humana, 2015, 60(11): 665.
5. Ka S, Lee S, Hong J, et al.HLAscan: genotipagem da região HLA utilizando dados de sequenciação de nova geração. BMC bioinformática, 2017, 18(1): 258.
6. Picascia, A., Grimaldi, V., Napoli, C. Da tipagem de HLA à deteção de anticorpos anti-HLA e além: O caminho a seguir. Revisões de Transplante, 2016, 30(4), 187-194. doi:10.1016/j.trre.2016.07.007.