Sequenciação do Repertório Imune

O que é o Repertório Imune

O sistema imunológico adaptativo desempenha um papel extremamente importante na contrariedade a patógenos infecciosos e na proteção do corpo humano. A base do sistema imunológico adaptativo depende fundamentalmente da enorme diversidade de receptores de células T e outros receptores imunológicos que podem reconhecer epítopos de um número astronómico de diferentes antígenos exógenos e fatores endógenos do hospedeiro.

O repertório imunitário é conhecido como a coleção de células imunitárias funcionalmente diversas no sistema circulatório, que é uma medida chave da complexidade imunológica. As células T e outras células imunitárias orquestram, respetivamente, as respostas imunitárias celulares e humorais no organismo. Cada uma delas funciona através dos seus recetores de superfície para reconhecer e ligar-se a antígenos, desempenhando um papel crítico na eliminação de patógenos ou células tumorais intrabody. Operando de forma independente, as células T e estas outras células imunitárias mediam as respostas imunitárias celulares e humorais complementares do corpo, cada uma utilizando os seus recetores específicos na superfície. Estes recetores facilitam a identificação e ligação a antígenos, desempenhando assim um papel fundamental na eliminação de patógenos ou células tumorais endógenas. O estudo do repertório imunitário é crucial para compreender a resposta da imunidade adaptativa e, em última análise, lança luz sobre a descoberta de novos agentes infecciosos e possui um potencial inestimável para ajudar no desenvolvimento de anticorpos ou vacinas, diagnóstico clínico, tratamento e prevenção.

Se quiser saber mais sobre a introdução do Sequenciamento do Repertório Imune, consulte o nosso artigo "Sequenciação do Repertório Imune: Introdução, Fluxo de Trabalho e Aplicações.

Sequenciação de Repertório Imune de Alto Rendimento

As estratégias tradicionais para estudar o repertório imune, que incluem o espectratipagem, Sequenciação de Sanger et al., são trabalhosos, dispendiosos e insuficientes para gerar uma imagem de alta resolução do repertório imune. NGS (sequenciação de nova geração) oferece uma abordagem poderosa capaz de analisar o repertório imune de forma de alto rendimento. Ao fornecer enormes dados de sequenciação, NGS criou uma imagem de resolução sem precedentes do repertório imunitário, que oferece um grande potencial para revelar mudanças dinâmicas nas populações clonais durante a estimulação antigénica.

Sequenciação do Repertório Imune - Regiões Alvo

No domínio do sequenciamento do repertório imunitário, o foco está nos linfócitos T/B. Utilizando técnicas como PCR multiplex ou 5'RACE, o objetivo é amplificar as regiões determinantes complementares (CDR3) que determinam a diversidade dos recetores de células B ou Receptores de células TA CDR3, sendo a região mais variável, é o epicentro da exploração em estudos de sequenciação do repertório imune. A sua proeminência é sublinhada pelo seu estatuto como o domínio mais extensivamente investigado dentro da área.

Figura 1. Estrutura da IgG (Brian Douglas Weitzner 2015)

O que é a Sequenciação BCR?

A sequenciação BCR utiliza sequenciação de alto rendimento para detectar a amplificação direcionada das cadeias pesadas e leves do BCR. Analisa de forma abrangente as sequências base resultantes das rearranjos genéticos do BCR, juntamente com a abundância de cada sequência. Esta técnica encontra aplicação na investigação dos perfis transcricionais e inter-relações de diferentes clones de células B, aprofundando-se na especificidade funcional das células B. Consequentemente, ajuda a elucidar fenómenos como a tolerância da resposta imune humoral e o papel das mutações de alta frequência no reconhecimento anormal de antígenos pelas células B.

As aplicações do BCR-Seq abrangem:

• Triagem de mutações somáticas em populações celulares de pacientes com doenças primárias de imunodeficiência, como a deficiência isolada de IgA.
• Orientar o tratamento de doenças autoimunes (por exemplo, LES, esclerose múltipla, diabetes tipo 1) e monitorizar a progressão da doença durante o tratamento.
• Avaliação da eficácia e tolerância dos tratamentos medicamentosos para doenças infeciosas e tumores malignos.
• Prever e intervir nas reações de rejeição de transplantes, fornecendo orientação sobre tolerância e respostas de rejeição.

O que é Sequenciação TCR

Sequenciação de receptores de células T (TCR-Seq) utiliza sequenciação de alto rendimento (HTS) para detectar a amplificação direcionada de moléculas de superfície determinantes de reconhecimento de antígenos por células T. Analisa a sua diversidade, juntamente com as sequências base de rearranjo do gene TCR e a abundância de cada sequência antes e depois do reconhecimento de antígenos por células T. Esta técnica reflete as alterações na resposta imune celular mediada por células T em estados fisiológicos e patológicos. É instrumental no estudo dos perfis transcricionais e inter-relações de diferentes clones de células T, revelando assim níveis mais profundos de especificidade funcional das células T.

As aplicações do TCR-Seq incluem:

• Deteção e orientação do monitoramento e tratamento da imunoterapia pós-tumoral.
• Avaliação da eficácia e tolerância da imunoterapia anti-infecciosa.
• Previsão e orientação da rejeição aguda em reações de rejeição de transplante.
• Ensaios clínicos e investigação científica sobre doenças autoimunes.
• Biomarcadores e diagnósticos para várias doenças infecciosas e neuroplásticas.

Serviço de Sequenciação de TCR

A CD Genomics desenvolveu avançados TCR Estratégia de sequenciação para amplificar e sequenciar o repertório imunitário com Sequenciação de Nova Geração (NGS). Agora, estamos a fornecer uma solução abrangente para avaliar a diversidade do repertório imunitário de forma precisa e económica, através da combinação de amostras. Podemos adaptar a construção de bibliotecas e os protocolos de sequenciação para atender aos requisitos específicos de diferentes tipos de amostras e projetos de investigação, garantindo uma abordagem personalizada para os nossos clientes. Além disso, integramos algoritmos bioinformáticos de ponta para facilitar a análise visual de dados, alinhando-nos com os padrões de liderança mundial em biologia computacional.

A nossa estratégia de sequenciação do repertório imune é capturar a região determinante complementar (CDR) do receptor de células T (TCR) utilizando métodos de múltiplas PCR ou 5' RACE, seguidos de sequenciação profunda. O fluxo de trabalho para a estratégia está ilustrado na figura abaixo.
A construção bem-sucedida de bibliotecas de TCR pode ser alcançada utilizando amostras obtidas através da separação de células T positivas para CD3 por meio de classificação com esferas magnéticas imunológicas e centrifugação em gradiente de Ficoll-Paque para a separação de linfócitos do sangue periférico.

Figura 2. Esquemas dos passos para sequenciação de alto rendimento do repertório de sequências de Ig (Georgiou et al., 2014).

Seleção de Duas Técnicas de PCR

Nota: Escolha diferentes plataformas de sequenciação e modos com base em diferentes necessidades.

Quais são as Vantagens do Sequenciamento do Nosso Repertório Imunitário

• Serviço Abrangente e Completo: Oferecemos serviços profissionais que cobrem todo o processo, desde o design experimental, extração e amplificação de ácidos nucleicos de amostras, construção de bibliotecas, sequenciação, análise de informações até a mineração de dados.
• Técnicas de Amplificação de Ponta: Utilizando PCR multiplex ou tecnologia 5'RACE, empregamos primers otimizados através de ajustes em plasmídeos, reduzindo significativamente os vieses e alcançando amplificação equivalente para vários clones.
• Alta reprodutibilidade: Alta consistência de clones quando a mesma amostra é preparada em uma biblioteca duas vezes.
• Quantificação clonal mais precisa: Alinhando leituras de baixa qualidade com clones de alta qualidade para recuperar dados importantes, garantindo que não haja perda de informação sobre a quantificação clonal.
• Correção de erros aprimorada e gestão de incompatibilidades: Utilização de métodos de agrupamento em múltiplas camadas para corrigir erros introduzidos pela PCR e sequenciação.

Quais são as aplicações do sequenciamento do repertório imunitário?

• Terapia TumoralHá investigação sobre os linfócitos infiltrantes presentes em vários tipos de tumores (incluindo câncer colorretal, ovário, fígado e melanoma), acompanhando as mudanças no microambiente imunológico no início da formação do tumor. Isso ajuda a identificar alvos para a imunoterapia e, assim, a reforçar a resposta anti-tumoral e a eficácia desses tratamentos.
• Transplante e Reconstituição ImunitáriaDurante o transplante de órgãos ou medula óssea, frequentemente ocorre a indução de uma resposta de rejeição do hospedeiro, que pode levar a uma doença crónica do enxerto contra o hospedeiro. Nesses momentos, a tecnologia de sequenciação de imunoglobulinas pode ser utilizada para investigar o repertório de células T pós-transplante, facilitando a identificação de grupos de alto risco para infecções pós-operatórias e recidivas.
• Doenças AutoimunesOs investigadores analisam células imunes expressas de forma aberrante (células T ou anticorpos) e, assim, descobrem biomarcadores diagnósticos. A busca por biomarcadores que superem os padrões atuais e a investigação de mecanismos imunológicos relacionados à autoimunidade podem, portanto, fornecer uma base substancial para o diagnóstico e tratamento de doenças.
• Avaliação de Medicamentos e VacinasAvaliação de amostras de sangue periférico após medicação para a doença, verifica se o medicamento desencadeia uma resposta imunitária e a sua eficácia.
• Outros AspectosAs bibliotecas de imunoglobulina desempenham um papel crítico no estudo de doenças infeciosas, na mapeação de espectros imunes diferenciais e em investigações relacionadas a modalidades imunoterapêuticas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação do Repertório Imune

Especificação de Serviço

	Requisitos de Amostra Células T ordenadas RNA/PBMCS RNA: Quantidade Total: 2500 ng, Concentração: 235 ng/μL, RIN≥7.0, 285/185≥1.0, Linha de base & 5S: Linha de base suave, Pico 5S normal, Pureza: Sem contaminação por DNA, proteína/sal, amostras claras e não viscosas. RNA de sangue total/RNA de tecido: Quantidade total ≥1 μg, Concentração: 270 ng/μL, RIN ≥7.0, 285/185 ≥1.0. Células Ordenadas: Quantidade Sugerida para Extração de DNA: 21×106Extração de RNA Quantidade Sugerida: 2×106. Peso Seco de Tecido Animal Fresco: Quantidade Sugerida para Extração de DNA ≥200 mg, Quantidade Sugerida para Extração de RNA: ≥30 mg. Sangue Total: Quantidade Sugerida para Extração de DNA ≥2 mL.
	Estratégia de Sequenciamento PE150
	Análise Bioinformática Avaliação da Qualidade dos Dados de Sequenciamento Alinhamento e Anotação: Resultados Estatísticos da Informação Básica da Amostra, Resultados Estatísticos da Informação de Anotação do Contig da Amostra, Resultados Estatísticos da Informação de Anotação da Sequência de Consenso da Amostra. Tipagem de Clonótipos Análise de Diversidade: Comparação de Clonótipos entre Amostras, Análise de Agrupamento de Clonótipos Sobrepostos, Análise Diferencial de Clonótipos Sobrepostos. Análise de Caracterização de População Clonal de Amostra Única: Análise de Características CDR3, Análise de Características de Genes V/J, Análise de Características Emparelhadas V-J.

Pipeline de Análise

Entregáveis

• Os dados de sequenciação originais
• Resultados experimentais
• Relatório de análise de dados
• Detalhes na Sequenciação do Repertório Imune para a sua escrita (personalização)

Referência:

1. Gravina, S et al. Sequenciação de bisulfito em todo o genoma a nível de célula única revela uma extensa heterogeneidade no metiloma do fígado de rato. Biologia Genómica, 2016 17(1):150.

1. O que distingue os genes de codificação das cadeias TCR e BCR? Existe uma cadeia recomendada?

As cadeias Beta dos Receptores de Células T (TCR) e as cadeias Pesadas dos Receptores de Células B (BCR) são codificadas por genes variáveis (V), de diversidade (D) e de junção (J), enquanto as cadeias Alpha dos TCR e as cadeias Leves dos BCR são codificadas apenas por genes V e J. Uma revisão da literatura científica atual sugere uma maior proeminência de investigação focada na cadeia Beta dos TCR e na cadeia Pesada dos BCR. Consequentemente, estas podem ser recomendadas para estudos relevantes, embora a escolha deva ser, em última análise, orientada pelo projeto e pela hipótese.

2. A sequenciação do repertório de imunoglobulinas pode distinguir entre IgG, IgM, IgD e IgE?

Ao sequenciar a região constante (C), os isoformas de imunoglobulinas (IgG, IgM, IgD e IgE) podem ser claramente delineadas. Os primers necessários para tal diferenciação estão disponíveis. No entanto, é imperativo que as amostras sejam de RNA. Isso é realizado através de um método de PCR multiplex que utiliza primers da região variável (V) até à região constante (C). A sequência distintiva tem aproximadamente 30 pares de bases, resultando em produtos que têm cerca de 200-300 pares de bases de comprimento.

3. Para a sequenciação do repertório imune, é melhor usar DNA genómico ou RNA como template?

No contexto da sequenciação do repertório imunitário, tanto o DNA genómico (gDNA) como o RNA desempenham papéis distintos e trazem o seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens:

Ao utilizar gDNA como material de template, os benefícios incluem uma reflexão precisa sobre a contagem de clones de recetores de células imunes, devido ao fato de que cada gene tem apenas duas cópias. Para não mencionar, o DNA é uma molécula estável que facilita o processo de armazenamento. No entanto, uma possível desvantagem do uso de gDNA reside no seu baixo número de cópias, o que pode exigir uma quantidade elevada de material da amostra. Além disso, a grande região intrónica entre as regiões J e C pode dificultar a amplificação do CDR de comprimento total devido a limitações de comprimento de sequenciação.

Por outro lado, o uso de RNA permite o design de primers na região C, o que possibilita a amplificação do CDR completo, graças à ausência de íntrons entre as regiões J e C. Devido aos seus altos níveis de expressão, a quantidade de template a partir de RNA é geralmente elevada, portanto, pode ser necessário menos material da amostra. No entanto, deve-se notar que a clonalidade dos receptores das células imunes pode ser influenciada pelos níveis de expressão de mRNA, o que pode impedir uma reflexão objetiva da contagem real de clones. Além disso, o RNA é menos estável do que o DNA, o que requer procedimentos rigorosos para a preservação e manuseio da amostra.

4. Que informações podem ser obtidas a partir do IR-seq?

A aplicação da sequenciação de imunoglobulina ou de recetores (IR-seq) pode fornecer informações consideráveis sobre a heterogeneidade e clonabilidade das populações de células T e B dentro de um indivíduo. A IR-seq permite a identificação de específicos receptor de células T (TCR) ou sequências de recetores de células B (BCR), facilitando a avaliação da expansão clonal, permitindo uma compreensão abrangente do repertório, revelando alterações em resposta a estímulos, seja infecção, vacinação ou manifestações de doenças autoimunes.

5. Quais são os principais passos envolvidos no IR-seq?

A execução do IR-seq é um processo em múltiplas fases. Começa com a coleta da amostra, geralmente sangue periférico ou uma biópsia de tecido. A extração de RNA ou DNA segue-se, seguida pela amplificação dos genes TCR ou BCR, realizada através de métodos como PCR ou enriquecimento direcionado. Isto é rapidamente sucedido por sequenciação de alto rendimentoO passo final envolve a análise bioinformática, com o objetivo de identificar e quantificar sequências únicas de TCR ou BCR presentes.

6. Quais são as principais aplicações do IR-seq?

A Sequenciação do Repertório Imune (IR-seq) é uma ferramenta seminal, com aplicações abrangentes tanto na imunologia como na investigação clínica. É utilizada de forma assídua na exploração das respostas imunes a fatores externos, como patógenos e tumores, bem como a desafios internos, como doenças autoimunes. Além disso, a sua eficácia estende-se ao monitoramento de eventos como transplantes para determinar casos de rejeição de órgãos e avaliar a diversidade e senescência do sistema imunitário.

7. Quais são algumas tecnologias emergentes em IR-seq?

No campo em constante evolução da IR-Sequencing, várias tecnologias progressivas estão a estabelecer-se. Notavelmente, o IR-seq de célula única é uma delas, que oferece a capacidade de perfilar células imunes individuais. Outra é o IR-seq espacialmente resolvido, que facilita o mapeamento de repertórios imunes dentro de regiões específicas de tecido. Além disso, o advento do aprendizado de máquina e da inteligência artificial está a reforçar significativamente a análise de volumosos conjuntos de dados de IR-seq, ajudando a destilar insights significativos e potencialmente revolucionários.

A imunosequencia identifica assinaturas da história de exposição ao citomegalovírus e efeitos mediados pelo HLA no repertório de células T.

Revista: Nature Genetics
Fator de impacto: 27,125
Publicado: 03 de abril de 2017

Fundo

A eficácia do sistema imunitário adaptativo contra infecções depende da produção de diversos heterodímeros αβ por células T. Receptores de células T (TCRs) via recombinação V(D)J. A especificidade do TCR surge da diversidade de sequências, particularmente na região CDR3. As células T proliferam após o reconhecimento de antígenos, formando populações de memória com rearranjos de TCR idênticos. Apesar da vasta diversidade do TCRβ, respostas públicas de células T ocorrem quando certas cadeias TCRβ são partilhadas entre indivíduos, especialmente em resposta a antígenos comuns. Respostas públicas de células T são observadas em várias doenças infecciosas e condições como malignidades e autoimunidade. Sequenciação de alto rendimento dos cadeias TCRβ permite a identificação de associações significativas entre sequências de TCR e fenótipos específicos, oferecendo potenciais aplicações diagnósticas para condições relacionadas com o sistema imunitário.

Métodos

Resultados

O estudo teve como objetivo identificar sequências de TCRβ associadas ao CMV, analisando amostras de sangue periférico de 641 indivíduos com serostatus conhecido para CMV. Através de análise estatística, 164 cadeias de TCRβ foram encontradas significativamente enriquecidas entre os indivíduos CMV+. A investigação subsequente da restrição HLA revelou que 45 dessas cadeias de TCRβ estavam associadas a alelos específicos de HLA-A ou HLA-B. A comparação com sequências de TCRβ reativas ao CMV previamente relatadas mostrou que, embora algumas se sobrepusessem, muitas não apresentaram incidência diferencial entre os indivíduos CMV+ e CMV- nesta coorte. Uma análise adicional, incorporando métricas de presença/ausência e abundância, identificou sequências de TCRβ reativas ao CMV adicionais, sugerindo a eficácia desta abordagem na identificação de sequências relevantes de TCRβ associadas à infecção por CMV.

Fig. 1. Identificação dos TCRβs associados ao CMV.

Este estudo controlou a profundidade da amostragem do repertório e observou uma associação distinta entre o número de sequências TCRβ relacionadas com o CMV e o serostatus do CMV. Os investigadores construíram um classificador binário para prever o serostatus do CMV com base na presença ou ausência de sequências TCRβ específicas para o CMV, alcançando uma precisão notável (um AUROC de 0,99 para todos os dados e 0,93 para validação cruzada). Uma validação adicional realizada numa coorte coletada de forma independente confirmou a robustez do classificador, evidenciada por um AUROC de 0,94 e demonstrando alta sensibilidade e especificidade. Estes resultados ilustram, assim, o notável potencial diagnóstico desta abordagem.

Fig 2. A incidência dos TCRβs associados ao CMV é diagnóstica do serostato do CMV.

Conclusão

O estudo investigou se as assinaturas de exposição a patógenos poderiam ser detectadas através da análise de dados públicos. Receptores de células T (TCRs) no repertório de células T de 666 sujeitos com estado sorológico conhecido para CMV. Desenvolveram uma estrutura estatística para diagnosticar o estado de CMV com precisão, alcançando alta especificidade e sensibilidade tanto na coorte original como na de validação. Além disso, identificaram moléculas TCRβ associadas ao CMV e previram com precisão os alelos HLA-A e HLA-B. A abordagem tem um amplo potencial para diagnosticar vários estados de doenças e fenótipos imunológicos, oferecendo uma estratégia de diagnóstico altamente paralelizável baseada no formato comum da recombinação somática de TCR.

Referência:

1. Emerson R O, DeWitt W S, Vignali M, et al. A imunosequencia identifica assinaturas da história de exposição ao citomegalovírus e efeitos mediados pelo HLA no repertório de células T. Genética da Natureza, 2017, 49(5): 659-665.