Visão Geral do Tipagem HLA Baseada em Sequenciamento de Próxima Geração

Teste HLA de alta resolução

Embora a sequenciação Sanger seja atualmente o principal método para tipagem de HLA e seja utilizada em laboratórios de compatibilidade tecidual de HLA e hospitais clínicos, a baixa capacidade de processamento e o tempo consumido são as principais desvantagens. Em segundo lugar, a isolação de sequências de alelos de HLA em espécimes heterozigóticos pela sequenciação de primeira geração também requer uma abordagem mais complexa e dispendiosa para ser alcançada. A sequenciação de nova geração está rapidamente a tornar-se mais amplamente utilizada devido ao aumento dramático na capacidade de processamento e velocidade, e à capacidade de completar a fase completa, tipagem HLA de alta resolução num único ciclo de digitação.

A captura por hibridização baseada em sequenciação de próxima geração permite a tipagem HLA de alta resolução, em grande escala e a baixo custo. A alta tolerância para polimorfismos de sequência é uma vantagem notável da captura por hibridização em relação ao enriquecimento de sequência alvo baseado em PCR.

Com o desenvolvimento da tecnologia molecular e a melhoria das necessidades médicas modernas, a tecnologia de tipagem HLA passou pelo processo de desenvolvimento de tipagem serológica e citológica com menor resolução e precisão para genotipagem com maior resolução e precisão.

Existem quatro genotipagens HLA comuns:

PCR-SSP (PCR com primers específicos de sequência)

PCR-SSOP (PCR com sondas oligonucleotídicas específicas de sequência)

SBT (Tipagem baseada em sequenciamento)

NGS (Tipagem baseada em Sequenciação de Nova Geração)

Aplicação de Sequenciação de Nova Geração na Tipagem de HLA

A aplicação de sequenciação de próxima geração para tipagem de HLA é dividida em 3 etapas: (1) sequenciação e tipagem das regiões polimórficas de HLA; (2) sequenciação por PCR de longo alcance e tipagem do gene HLA completo ou de exões inteiros; (3) sequenciação em tempo real de molécula única (SMRT) com vantagem de comprimento de leitura para sequenciação e tipagem direta de HLA-I e (ou) HLA-II. As duas primeiras etapas são realizadas pelos sistemas 454, PGM e MiSeq/HiSeq, enquanto a terceira etapa é principalmente alcançada pelo sequenciador SMRT da Pacific Biosciences.

O sistema de sequenciação 454 foi utilizado pela primeira vez para tipagem de HLA, e o princípio é a sequenciação por pirofosfato. O comprimento da leitura aumentou de 100-150 pb para 700 pb, e a sua principal vantagem é a rapidez da sequenciação e o longo comprimento da leitura.

A vantagem do comprimento de leitura é crítica para produzir resultados de alta resolução e precisão, e reduz significativamente os resultados incertos em comparação com o SBT.

2. A sequenciação PGM é uma tecnologia de sequenciação de próxima geração de baixo custo e rápida, mas o seu comprimento de leitura curto (cerca de 400 bp) torna a análise de dados relativamente difícil. De estudos recentes, embora limitada pelo comprimento da leitura, a PGM ainda pode obter resultados de alta qualidade em pouco tempo, com base na tipagem após a sequenciação completa do HLA ou na tipagem de exões polimórficos convencionais através da sequenciação. A questão premente é melhorar ou desenvolver software de processamento de dados conveniente.

3. O sistema de sequenciação MiSeq/HiSeq utiliza uma tecnologia de sequenciação por terminação reversível para sequenciação por síntese. Em comparação com outras sequenciações de próxima geração, o HiSeq é menos dispendioso, tem maior rendimento (600 G/corrida) e sequencia rapidamente. É muito superior ao método SBT em termos de rendimento, relação custo-eficácia, resolução e velocidade de tipagem. Em comparação com o PGM, o MiSeq obtém um alto rendimento, baixa taxa de erro e tempo mais curto.

A SMRT tem as vantagens de alta velocidade e longas sequências de saída, mas a sua taxa de erro de sequenciação é elevada.

O sequenciador RSII, lançado em abril de 2013, tem um comprimento médio de leitura de 3000 pb, o que permite realizar tipagens de alta resolução e obter sequências completas dos genes HLA. À medida que a tecnologia amadurece, a SMRT pode também aumentar o comprimento da leitura para 20 kb, o que pode resolver adequadamente o problema de ambiguidade na tipagem. Num futuro próximo, a tecnologia SMRT irá revolucionar a tecnologia de tipagem HLA baseada em sequenciação de nova geração.

Em termos de tipagem HLA, o sistema 454 foi o primeiro a ser utilizado, o HiSeq da Illumina, com a sua alta produção de dados e custo económico, ocupa uma posição importante na área, MiSeq/HiSeq e PGM são atualmente as plataformas de tipagem por sequenciação mais amplamente utilizadas, enquanto o SMRT e o sistema 454 têm a vantagem de leituras longas, e o SMRT tem o potencial de assumir o controle mais tarde.

Fluxo de trabalho NGS de alto rendimento (PLoS ONE 11(10) 2016).

Características da tipagem HLA baseada em tecnologia de sequenciação de nova geração

Além de alta capacidade de processamento, curto tempo de ciclo experimental e baixo custo, a tipagem HLA baseada em tecnologia de sequenciação de nova geração apresenta as seguintes vantagens:

1. Resultados de digitação em alta resolução

A tipagem HLA de alta resolução é essencial para melhorar o sucesso dos transplantes e reduzir a incidência da doença enxerto-versus-hospedeiro. Antes do advento do sequenciamento de nova geração, havia duas maneiras de obter resultados de alta resolução: (1) após obter resultados de tipagem de baixa resolução, selecionar sondas ou primers apropriados para obter a tipagem de alta resolução; (2) após a tipagem pelo método SBT, confirmar os resultados incertos utilizando os métodos PCR-SSP ou PCR-SSO para determinar a tipagem precisa e de alta resolução. O método de sequenciamento de nova geração, que é semelhante ao método SBT, é o método de tipagem mais preciso e direto para obter resultados de alta resolução, e pode resolver os resultados de tipagem HLA ambígua na tipagem SBT.

2. Resolvendo o problema da ambiguidade

A percentagem de resultados ambíguos de HLA-A e B obtidos com base no método SBT pode atingir 76,31% e 91,08%, o que é uma desvantagem importante do padrão ouro de tipagem de HLA - o método SBT. Existem dois mecanismos para gerar resultados ambíguos: (1) ambiguidade de fase. Quando o local do gene HLA da amostra é heterozigoto, as sequências de diferentes combinações alélicas podem apresentar os resultados da mesma combinação de tipagem. (2) As sequências de bases da região de deteção convencional são idênticas, e a diversidade alélica está localizada fora da região de sequenciação. As soluções incluem o uso de SBT com PCR-SSO SSP, sequenciação da região fora da região de deteção convencional de HLA ou sequenciação após a separação dos dois alélos, mas esses métodos são demorados e trabalhosos.

A tipagem de HLA baseada em sequenciação de nova geração pode evitar efetivamente este problema: (1) a fragmentação do gene amplifica e sequencia fragmentos de DNA individuais, obtendo eficazmente a fase de ligação do polimorfismo; (2) a sequenciação massivamente paralela permite que cada ronda de reação produza um grande número de exões, intrões e até mesmo resultados de sequenciação de genes HLA inteiros a partir de diferentes localizações genéticas (ou diferentes espécimes), que podem ser utilizados para completar uma tipagem precisa.

Além disso, à medida que mais e mais novos alelos são descobertos, a variedade e a proporção de combinações de resultados ambíguos aumentarão, o que também impulsionará o uso de sequenciação de nova geração para tipagem de HLA.

Tipagem de sequenciação do exoma completo/genoma completo

A tipagem por sequenciação convencional foca nas regiões polimórficas dos genes HLA, ou seja, nos exões 2 e 3 dos genes HLA de classe I e no exão 2 dos genes HLA de classe II. Devido a razões de custo e técnicas, apenas cerca de 10% dos genes nomeados na base de dados IMGT/HLA têm sequências completas dos genes HLA.

Com a maturação dos métodos de tipagem de HLA por sequenciação de nova geração e a redução dos custos de sequenciação, a tipagem de HLA por sequenciação de exoma completo ou genoma completo tem sido cada vez mais relatada. Este método é benéfico para descobrir novos alelos de HLA, resolver ambiguidades e obter ultra-alta resolução, o que pode enriquecer os dados da base de dados IMGT/HLA e do transplante de medula óssea, além de facilitar o estudo do polimorfismo de HLA e da evolução molecular na população, proporcionando grande conveniência para futuras pesquisas científicas e trabalho clínico.

As limitações da tipagem de HLA por sequenciação de nova geração

No entanto, antes que esta aplicação se torne popular, permanecem os seguintes obstáculos: (1) embora o desempenho do método de sequenciação de próxima geração tenha melhorado significativamente em comparação com outros métodos, é indubitavelmente um projeto que exige muito trabalho, materiais e recursos financeiros para obter uma sequência do genoma completo HLA em grande escala; (2) as especificações operacionais da tipagem de sequenciação do genoma completo ou do exoma completo por sequenciação de próxima geração precisam ser gradualmente melhoradas; (3) a tipagem de sequenciação do genoma completo está destinada a descobrir um grande número de novos alelos HLA, e questões como a sua nomeação e confirmação, bem como a integração e partilha de informações massivas, precisam ser consideradas.

O surgimento de novas tecnologias, juntamente com as vantagens óbvias, também apresenta certas limitações. As deficiências da tipagem de HLA por sequenciação de nova geração residem principalmente em: (1) comprimento de leitura curto, que é o principal gargalo da tecnologia de sequenciação de nova geração e traz certas dificuldades para a montagem do genoma posterior; é encorajador que o comprimento de leitura SMRT ainda possa ser realizado de forma eficiente para a tipagem de HLA; (2) altas exigências de análise de dados e software, uma série de excelentes softwares de processamento de dados surgiu em consequência, como Omixon Target HLAE201, NGSengine, HLAreporter, Op-tiType, etc.

Conclusão

Como uma tecnologia clássica de genotipagem HLA, PCR-SBT/SSP/SSO continua a ser o método principal a nível internacional, mas a tipagem HLA por sequenciação de nova geração apresenta vantagens óbvias em termos de alta capacidade de processamento, alta resolução, resolução de resultados de tipagem ambígua e descoberta de novos alelos. Com o desenvolvimento da tecnologia e a popularização da aplicação, experimentos de controlo com grandes tamanhos de amostra sob diferentes plataformas de sequenciação de nova geração; melhoria do sistema de nomenclatura e estabelecimento de plataformas de partilha de informação; desenvolvimento e avaliação de software de processamento de dados, bem como o desenvolvimento de protocolos de operação padronizados, merecem uma atenção adicional em futuras investigações. Devido à complexidade das moléculas HLA, a descrição da diversidade HLA na população e a exploração dos mecanismos evolutivos parecem ser relativamente difíceis. Estudos de tipagem HLA baseados em sequenciação de nova geração proporcionam conveniência para o estabelecimento de bibliotecas de medula óssea em larga escala, trabalho de correspondência de alta eficiência e o estudo da estrutura do gene HLA e da função molecular, o que levará ao desenvolvimento adicional da investigação e aplicações HLA.

Referências:

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