Triagem de Bibliotecas de Exibição de Fagos: Introdução, Fluxo de Trabalho e Aplicações

Introdução ao Sequenciamento de Triagem de Anticorpos ou Triagem de Bibliotecas de Exibição de Fagos

A exibição de fagos é uma ferramenta de laboratório popular e eficaz para descobrir peptídeos que se ligam a qualquer alvo. Este método baseia-se tipicamente em bibliotecas de partículas de fagos que contêm milhões ou até bilhões de peptídeos exógenos ligados a proteínas de superfície de fagos. A biblioteca altamente diversa é reduzida a algumas opções através de várias rondas de seleção, também conhecidas como biopanning, e a amplificação é necessária para aumentar os clones de fagos que apresentam peptídeos de ligação ao alvo, a fim de avaliar os ligantes com alta afinidade e especificidade. Dado que fragmentos de anticorpos, como scFv ou Fab, são rapidamente expressos e exibidos em fagos, a tecnologia de exibição de fagos desempenha um papel crítico na descoberta e engenharia de anticorpos.

A análise das sequências de peptídeos na biblioteca é crucial para a exibição de fagos. Clones individuais de fagos devem ser isolados para sequenciamento convencional de Sanger. É um processo demorado e em pequena escala que depende de amplificações repetidas. As limitações do método incluem a geração de viés seletivo não intencional contra certas sequências de anticorpos em bactérias e a incapacidade de avaliar mais de cem clones da biblioteca.

Quando se trata de analisar triagens de exibição de fagos, o sequenciamento profundo da Illumina tem muitos benefícios, especialmente para grandes coleções de sequências. Para começar, permite experimentos de exibição de fagos com menos, e eventualmente apenas uma, ronda de seleção, potencialmente evitando problemas causados por viés indesejado e colapso da diversidade durante o processo de amplificação, permitindo a descoberta de ligandos que foram previamente perdidos ou sub-representados em triagens de exibição de fagos. Além disso, plataformas de NGS podem caracterizar até 10⁶–10⁸ sequências em uma única corrida, permitindo uma cobertura de conteúdo muito mais representativa e, portanto, útil.

Figura 1. Uma visão geral do processo de seleção de fagos. (Christiansen, 2015)

Fluxo de Trabalho Geral para Sequenciamento de Triagem de Anticorpos

As diretrizes básicas para o sequenciamento de triagem de anticorpos são as seguintes:

- Utilizando várias tripsinas, a proteína do anticorpo é primeiro digerida em peptídeos sobrepostos.

- Digestão LC-MS/MS, seguida de otimização de fragmentação.

- O sequenciamento de peptídeos de novo é utilizado para identificar peptídeos sobrepostos.

- Montagem automatizada da sequência de anticorpos utilizando peptídeos que foram categorizados.

- Os dados são analisados utilizando algoritmos computacionais de ponta para determinar rapidamente a sequência de aminoácidos do peptídeo digerido. Aplicações do Sequenciamento de Triagem de Anticorpos

Descoberta de anticorpos por sequenciamento de repertórios imunes

Vários compartimentos imunes de diferentes hospedeiros mamíferos foram analisados após a imunização para encontrar novos anticorpos monoclonais utilizando sequenciamento de alto rendimento e avaliação bioinformática. Três métodos diferentes mostraram ser eficazes nesse sentido.

Sequenciamento de repertórios de anticorpos recombinantes

Ig-seq pode ser empregado para investigar uma variedade de bibliotecas de anticorpos recombinantes, incluindo bibliotecas ingênuas, focadas, imunes, semi-sintéticas e totalmente sintéticas, além de minerar diretamente repertórios de anticorpos derivados de células B naturais de animais e humanos. Plataformas de triagem in vitro, como exibição de fagos, leveduras e ribossomos, são adequadas para esses repertórios. Um dos principais objetivos desses esforços de sequenciamento é capturar e deduzir métricas de qualidade da biblioteca que indiquem a probabilidade de isolar efetivamente anticorpos com características preferidas de uma biblioteca recombinante fornecida.

Combinando triagem de alto rendimento e sequenciamento para descoberta e engenharia de anticorpos monoclonais

Para que o sequenciamento de alto rendimento ofereça uma perspectiva significativa e aprofundada das possíveis variedades de bibliotecas específicas de antígenos, a diversidade deve ser consideravelmente reduzida para obter toda a capacidade de uma dada biblioteca de anticorpos natural ou recombinante (geralmente na faixa de 10⁶–10¹¹ clones). Como resultado, integrar Ig-seq com um filtro de sequência baseado em fenótipo e pressão de seleção, como os fornecidos pela exibição de fagos ou leveduras, é um método viável para interrogar seletivamente bibliotecas de anticorpos em profundidade.

Referências:

1. Fischer N. Sequenciamento de repertórios de anticorpos: a próxima geração. InMAbs 1 de janeiro de 2011 (Vol. 3, No. 1, pp. 17-20). Taylor & Francis.
2. Parola C, Neumeier D, Reddy ST. Integrando triagem de alto rendimento e sequenciamento para descoberta e engenharia de anticorpos monoclonais. Imunologia. Janeiro de 2018;153(1).
3. Thompson KL, Rosenzweig BA, Pine PS, et al. Uso de um design de RNA de tecido misto para avaliações de desempenho em múltiplos formatos de microarray. Pesquisa de ácidos nucleicos. 1 de janeiro de 2005;33(22).
4. Christiansen A, Kringelum JV, Hansen CS, et al. Sequenciamento de alto rendimento melhorado pela exibição de fagos permite a identificação de motivos epítopos específicos de pacientes no soro. Relatórios científicos. 6 de agosto de 2015;5(1).