O que é o Sequenciamento do Repertório do Receptor de Células B?

O que é BCR-seq?

O sequenciamento de recetores de células B (BCR-seq) representa um método avançado e rápido para a deteção exaustiva de recetores de células B (BCRs) amplificados por alvo, através da integração da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento e bioinformática. Ao analisar a abundância de cada sequência, BCR-seq revela as complexidades das respostas imunes humorais mediadas por células B e a diversidade dinâmica das alterações de imunoglobulinas. Esta tecnologia de ponta permite uma exploração minuciosa dos mecanismos subjacentes que governam a capacidade do sistema imunitário de responder e adaptar-se, abrindo caminhos para uma compreensão mais profunda da dinâmica do sistema imunitário.

A CD Genomics também fornece serviço de sequenciamento de TCR baseado em sequenciamento de nova geração e sequenciamento de long-read.

Estrutura do BCR

O recetor de células B (BCR) atua como uma imunoglobulina ligada à membrana (Smlg), desempenhando um papel crucial no reconhecimento de antígenos pelas células B. Estruturalmente, o BCR é um tetramero, composto por duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), onde a cadeia leve pode ser κ ou λ. A cadeia H é intricadamente composta por quatro fragmentos de genes: 65-100 tipos de regiões variáveis (VH), dois tipos de regiões de diversidade (DH), seis tipos de regiões de junção (JH) e regiões constantes (CH).

Por outro lado, a cadeia L abrange três fragmentos de genes distintos, incluindo regiões variáveis (VH), regiões de junção (JH) e regiões constantes (CH). Especificamente, a cadeia L consiste em regiões variáveis (VH), regiões de junção (JH) e regiões constantes (CH), com cada região contribuindo para a funcionalidade geral do BCR. Esta disposição meticulosa assegura a capacidade do BCR de reconhecer uma ampla gama de antígenos, formando um componente crítico na intrincada maquinaria da resposta imune.

Mapas de Cryo-EM do BCR IgM. (Dong et al., 2022)

Diversidade do BCR

• Diversidade Resultante da Reorganização de Fragmentos de Genes (V, D e J)

As regiões variáveis (V) tanto das cadeias pesadas (H) como das cadeias leves (L) desempenham um papel crucial na diversidade do BCR. Compostas por três aminoácidos cada, estas regiões exibem alta variabilidade, formando regiões determinantes de complementaridade (CDRs) — CDR1, CDR2 e CDR3. Todas as três CDRs participam ativamente no reconhecimento de antígenos, determinando coletivamente a especificidade antigénica do BCR. Notavelmente, o gene que codifica a CDR3, posicionado na junção entre a cadeia leve V e J ou entre os fragmentos V, D e J da cadeia pesada, aumenta a diversidade do BCR ao incorporar inserções de nucleotídeos ou splicing durante as reorganizações V(D)J e nas junções V-D e D-J.

• Diversidade Proveniente de Combinações de Sequências de Nucleotídeos

A diversidade do BCR é ainda enriquecida através da combinação de numerosos fragmentos de genes da região V, tanto nas cadeias leves como pesadas. Além disso, as diversas combinações de genes V, D e J contribuem significativamente. Durante a reorganização, cada gene pode ser tomado apenas em um fragmento, acentuando a diversidade geral dos BCRs.

• Diversidade Induzida por Mutacões de Células Somáticas de Alta Frequência

Células B maduras dentro dos centros germinativos dos órgãos linfoides periféricos sofrem um aumento da frequência de mutações na região do gene V reorganizado (CDR3) após estimulação por anticorpos. Denominadas mutações de alta frequência em células somáticas, estas mutações, predominantemente mutações pontuais, ocorrem de forma não aleatória. Este processo contribui para a adaptabilidade dinâmica dos BCRs, melhorando a sua capacidade de responder a uma ampla gama de antígenos.

O Fluxo de Trabalho do Sequenciamento do Recetor de Células B (BCR)

• Isolamento e Captura de Células B

As células B são meticulosamente isoladas de amostras de sangue ou tecido, e o seu RNA é extraído.

• Transcrição Reversa para cDNA

O RNA extraído passa por transcrição reversa, transformando-se em DNA complementar (cDNA).

• Preparação da Biblioteca de Recetores

Usando o cDNA como molde, uma biblioteca de recetores é meticulosamente elaborada. Primers específicos, projetados estrategicamente com marcadores a montante e a jusante com base nas características dos genes, são utilizados. Após a amplificação por PCR, uma biblioteca de recetores abrangente é estabelecida. Todos os produtos resultantes, marcados para identificação, estão prontos para sequenciamento subsequente.

• Sequenciamento de Alto Rendimento

Utilizando tecnologias de sequenciamento de alto rendimento de última geração, as sequências de cDNA obtidas são meticulosamente registadas.

• Processamento de Dados Bioinformáticos

Os dados de sequenciamento adquiridos passam por uma análise bioinformática sofisticada. Isto abrange a filtragem meticulosa dos dados de sequenciamento, splicing de sequências, comparação de sequências VDJ e, por fim, a determinação e tradução das estruturas das sequências.

Abordagens para o sequenciamento do repertório de BCR e TCR. (Seah et al., 2018)

Aplicações do Sequenciamento de BCR

• Revelação da Patogénese e Monitorização Precoce da Doença

O sequenciamento de BCR serve como uma ferramenta poderosa para explorar as complexidades da patogénese da doença e permite a monitorização e diagnóstico precoces.

• Monitorização Dinâmica da Biblioteca de Recetores CDR3 do BCR para Eficácia de Medicamentos

A monitorização dinâmica da biblioteca de recetores CDR3 do BCR fornece uma valiosa oportunidade para observar a eficácia terapêutica dos medicamentos.

• Correlação entre Loci de Genes do Recetor de Células B e Ocorrência de Doenças

Investigar a correlação entre loci de genes do recetor de células B e o início e progressão de doenças específicas oferece insights vitais para a monitorização precoce e compreensão da patogénese da doença.

• Análise de Homologia Tumoral

O sequenciamento de BCR desempenha um papel crucial na análise da homologia tumoral dentro de um organismo, contribuindo para a nossa compreensão da biologia e progressão do câncer.

• Triagem de Mutacões de Células Somáticas em Imunodeficiências Primárias

Facilita a triagem de mutações de células somáticas, particularmente em pacientes com imunodeficiências primárias, como a deficiência isolada de IgA, ajudando em abordagens médicas personalizadas.

• Avaliação de Tolerância em Rejeição de Transplantes

O sequenciamento de BCR contribui para a avaliação da tolerância em cenários de rejeição de transplantes. Ajuda a prever ocorrências de rejeição e orienta estratégias de intervenção eficazes e atempadas.

Referências:

1. Dong, Ying, et al. "Princípios estruturais da montagem do recetor de antígeno de células B." Nature 612.7938 (2022): 156-161.
2. Seah, Yu Fen Samantha, Hongxing Hu, e Christoph A. Merten. "Tecnologia microfluídica de célula única em imunologia e triagem de anticorpos." Aspectos moleculares da medicina 59 (2018): 47-61.