Sequenciação de Sanger: Introdução, Fluxo de Trabalho e Aplicações

O que é a sequenciação de Sanger?

Sequenciação de SangerUm método de sequenciação de DNA, baseia-se na incorporação seletiva de didesoxirribonucleotídeos terminadores de cadeia durante a replicação in vitro do DNA, guiada pela ação da DNA polimerase. Esta técnica foi pioneira por Frederick Sanger e a sua equipa em 1977, daí o termo "Sequência de Sanger". Crucial para o método de sequenciação de Sanger é o fenómeno da terminação da reação da DNA polimerase instigada pelos trifosfatos de didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs)—um princípio que levou ao nome alternativo para a técnica, a "sequenciação por terminação de didesoxi". Comprovando a sua eficácia e fiabilidade, este método tem sido a técnica de sequenciação mais amplamente utilizada durante quase quatro décadas.

O Sequenciação de Sanger método, sustentado por uma taxa de precisão de 99,99% na identificação de bases, é amplamente considerado o 'padrão ouro' para verificar sequências de DNA. Isso inclui aquelas sequências de DNA inicialmente decifradas usando sequenciação de nova geração técnicas. O Projeto Genoma Humano, por exemplo, utilizou Sequenciação de Sanger para determinar as sequências de fragmentos relativamente curtos do DNA humano, cada um com 900 pares de bases ou menos. Estes fragmentos serviram como os blocos de construção para a construção de seções maiores de DNA, que, por sua vez, foram montadas para construir cromossomos inteiros.

Figura 1. Reação de terminação de cadeia na sequenciação de Sanger. (Saini et al., 2023)

Fluxo de Trabalho de Sequenciação Sanger

Sequenciação de Sanger envolve principalmente a formação de um sistema de reação, amplificação do segmento alvo, eletroforese em gel e leitura de sequências. O processo de Sequenciação de Sanger consiste num conjunto de quatro reações separadas, cada uma abrangendo: (1) os quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídeos (dNTPs), críticos para a síntese normal de DNA; (2) a inclusão de quatro trifosfatos de didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs) em cada sistema de reação. Uma vez que os ddNTPs estão desprovidos do grupo 3-OH necessário para a elongação, os oligonucleotídeos amplificados terminam seletivamente em G, A, T ou C. Para um posicionamento eficaz, estes são marcados com fluorescência ou isótopos. (3) O fragmento alvo, a DNA polimerase e os primers constituem todo o sistema de reação.

Subsequentemente, o fragmento alvo serve como o molde sob a catálise da DNA polimerase, iniciando a replicação do DNA a partir dos primers. Ao encontrar ddNTPs, a reação cessa. A eletroforese em gel que se segue tem como objetivo separar estes fragmentos de oligonucleotídeos terminados. Finalmente, os fragmentos são submetidos a uma corrente elétrica para induzir a formação de bandas. Sob as influências combinadas da corrente elétrica e da resistência do gel, bandas regulares emergem longitudinalmente a intervalos iguais, representando diferentes comprimentos de sequência, cada uma correspondendo a uma sequência A-T-G-C.

Figura 2. Fluxo de trabalho geral do sequenciamento de Sanger

Existem três etapas principais para Sequenciação de Sanger quais são os seguintes:

Sequência de ADN para PCR de Terminação de Cadeia

A sequência de DNA de interesse é utilizada como molde para um tipo especial de PCR chamado PCR de terminação de cadeia. A PCR de terminação de cadeia funciona exatamente como a PCR padrão, mas com uma grande diferença: a adição de nucleotídeos modificados chamados didesoxirribonucleotídeos. Na etapa de extensão da PCR padrão, a DNA polimerase adiciona dNTPs a uma cadeia de DNA em crescimento, catalisando a formação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo 3'-OH livre do último nucleotídeo e o 5'-fosfato do próximo.

Separação por Tamanho por Eletroforese em Gel

No segundo passo, os oligonucleotídeos terminados em cadeia são separados por tamanho através da eletroforese em gel. Na eletroforese em gel, as amostras de DNA são carregadas em uma extremidade de uma matriz de gel, e uma corrente elétrica é aplicada; o DNA é carregado negativamente, portanto, os oligonucleotídeos serão puxados em direção ao eletrodo positivo do lado oposto do gel. Como todos os fragmentos de DNA têm a mesma carga por unidade de massa, a velocidade com que os oligonucleotídeos se movem será determinada apenas pelo tamanho. Quanto menor for um fragmento, menos atrito ele experimentará ao se mover através do gel, e mais rápido ele se moverá. Como resultado, os oligonucleotídeos serão dispostos do menor para o maior, lendo o gel de baixo para cima.

Análise de Gel e Determinação da Sequência de DNA

O último passo envolve simplesmente ler o gel para determinar a sequência do DNA de entrada. Como a DNA polimerase apenas sintetiza DNA na direção 5' para 3', começando a partir de um primer fornecido, cada ddNTP terminal corresponderá a um nucleótido específico na sequência original (por exemplo, o fragmento mais curto deve terminar no primeiro nucleótido a partir da extremidade 5', o segundo fragmento mais curto deve terminar no segundo nucleótido a partir da extremidade 5', etc.). Portanto, ao ler as bandas do gel do menor para o maior, podemos determinar a sequência 5' para 3' da cadeia de DNA original.

Figura 3. Visão geral do sequenciamento Sanger

Vantagens da Sequenciação de Sanger

Sequenciação de Sanger é uma metodologia testada pelo tempo, famosa pela sua alta precisão. Esta técnica clássica identifica meticulosamente a ordem das bases no DNA, sendo particularmente eficaz quando aplicada a fragmentos de DNA relativamente curtos. Reconhecida pela sua robustez, o mecanismo simples e o processo consistente de Sequenciação de Sanger leva a um elevado grau de fiabilidade. Dada a operação adequada, proporciona resultados consistentes e reproduzíveis.

A sua aplicabilidade é ampla e adaptável, facilitando projetos de várias escalas, que vão desde o sequenciamento de genes singulares até genomas inteiros. Assim, encontra ampla utilização em investigação, diagnóstico clínico e outros domínios. Comparado a certos NGS as tecnologias, os custos associados de equipamentos e reagentes do sequenciamento Sanger são notavelmente mais baixos. Consequentemente, é uma opção atraente para aqueles projetos que lidam com orçamentos limitados. Quando se trata de sequenciar fragmentos de DNA longos, Sequenciação de Sanger exibe um desempenho superior em relação a alguns homólogos de próxima geração. Isto é criticamente importante para projetos que necessitam do sequenciamento de genes completos ou regiões específicas.

Aplicações da Sequenciação de Sanger

O sequenciamento de DNA Sanger é amplamente utilizado para fins de pesquisa, como (1) direcionar regiões genómicas menores em um maior número de amostras, (2) sequenciar regiões variáveis, (3) validar resultados de estudos de NGS, (4) verificar sequências de plasmídeos, inserções, mutações, (5) tipagem de HLA, (6) genotipagem de marcadores de microssatélites e (6) identificar variantes genéticas únicas causadoras de doenças.

Figura 4. Exemplos de sequências. Uma boa sequência de ácido nucleico. (Crossley et al., 2020)

Sequenciação de Sanger é fundamental em muitas áreas de pesquisa ainda hoje.

Na investigação em genómica, este processo é vital para a localização e clonagem de genes, identificando, localizando genes e verificando a precisão dos segmentos clonados. Embora o sequenciamento genómico não possa rivalizar com a velocidade de NGS tecnologias, Sequenciação de Sanger mantém-se relevante na sequenciação de pequenos genomas ou regiões específicas de genes. Também se revela útil na deteção de mutações, como Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNP), assim como inserções ou deleções. Na evolução molecular, Sequenciação de Sanger é utilizado para a identificação de espécies através da comparação das sequências genéticas de espécies conhecidas, a fim de determinar a filogenia de espécies desconhecidas. Através do sequenciamento do DNA de várias espécies, podemos revelar o parentesco e a história evolutiva de muitas espécies. Além disso, é fundamental no diagnóstico médico para identificar variações genéticas relacionadas a doenças genéticas e detectar mutações de oncogenes em células tumorais para orientar o tratamento.

Nos setores agrícola e de proteção ambiental, é utilizado para identificação de raças, determinando as variedades ou parentesco de culturas e gado. Além disso, a análise de DNA ambiental, realizada através do sequenciamento de DNA em amostras ambientais, fornece informações sobre a biodiversidade e a saúde dos sistemas ecológicos. Aplicações forenses de Sequenciação de Sanger são vistos na identificação pessoal através da sequenciação do DNA de indivíduos para identificação judicial e reconhecimento pessoal. A identificação por impressão digital de DNA, que utiliza este método, ajuda na análise de evidências de DNA em casos criminais e na confirmação da identidade de um suspeito. Além disso, aplicações emergentes incluem a sequenciação de células únicas, em conjunto com tecnologias de células únicas para explorar a expressão gênica e mutação de células individuais. O campo da epigenética apresenta Sequenciação de Sanger na identificação de marcadores epigenéticos como a metilação do DNA ou a modificação de histonas para obter uma compreensão mais profunda da regulação epigenética. Na biologia sintética, é utilizado para verificar a precisão e a função de sequências de DNA sintético.

Limitações da Sequenciação de Sanger

Âmbito de Aplicação Limitado: O Sequenciação de Sanger o método não é ideal para a análise de sequências de DNA mais longas ou para projetos de sequenciamento em grande escala. Devido à sua complexidade e custo, é mais apropriado para projetos de pequena escala com objetivos específicos.

Comprimento de Sequência Restrito: O comprimento das sequências que Sequenciação de Sanger a decodificação é restringida pelos específicos trifosfatos de dideoxirribonucleotídeo (ddNTPs) utilizados durante o processo de reação. Isso requer múltiplas rondas de reações e análises para sequenciação de fragmentos longos, o que, por sua vez, aumenta a carga de trabalho e o custo de tempo.

Baixo Rendimento: Comparado a certas tecnologias de NGS, Sequenciação de Sanger tem um rendimento relativamente mais baixo. Consequentemente, menos sequências podem ser concluídas dentro do mesmo período de tempo, tornando-o inadequado para projetos de sequenciação extensivos.

A Operação Manual Influencia a Precisão: A análise de eletroforese em gel e a interpretação do cromatograma de sequência, componentes integrais do processo de sequenciação de Sanger, muitas vezes requerem operação manual. Isso introduz potenciais julgamentos subjetivos e erros de operação, afetando, consequentemente, a precisão do resultado da sequenciação.

Comparação entre Sequenciamento Sanger e NGS

No discurso sobre Sequenciação de Sanger e sequenciação de próxima geração, abordamos implicitamente a evolução e o avanço nas técnicas de sequenciação de DNA. A sequenciação Sanger, uma técnica de sequenciação inicial, foi aclamada pela sua fiabilidade e precisão. No entanto, com o avanço científico, as tecnologias de NGS surgiram, impulsionando significativamente o desenvolvimento no campo da sequenciação de DNA. Existem diferenças conspícuas entre Sequenciação de Sanger e NGS tecnologias em aspetos como os seus princípios, capacidade, velocidade, custos, gama de aplicações e análise de dados.

Princípios e Técnicas:

O método de Sanger adota o método de terminação de cadeia. Esta técnica utiliza terminadores de cadeia di-desoxi marcados com cores de fluorescência distintas, permitindo a incorporação de uma base específica em cada posição na cadeia de ADN.

NGS as tecnologias representam um conjunto de métodos emergentes de sequenciação de alto rendimento, permitindo a sequenciação massiva de DNA em grande escala. Estas técnicas, incluindo Illumina, Ion Torrent, PacBio e outras, permitem a sequenciação simultânea de numerosos fragmentos de DNA, melhorando significativamente a velocidade e a eficiência da sequenciação.

Rendimento e Velocidade:

Sequenciação de Sanger é geralmente limitado ao manuseio de um número modesto de fragmentos de DNA, com um ritmo relativamente mais lento. Em contraste, as técnicas de NGS alcançam uma maior capacidade e velocidade, sendo capazes de processar simultaneamente centenas de milhões a bilhões de fragmentos de DNA e realizar o sequenciamento genómico completo em uma duração significativamente reduzida.

Custo:

Sequenciação de Sanger tende a ser relativamente caro, especialmente no que diz respeito a projetos de sequenciação em larga escala. NGS as tecnologias, por sua vez, provam ser mais rentáveis devido à sua capacidade de sequenciar uma grande quantidade de fragmentos de DNA de uma só vez, reduzindo assim o custo por fragmento.

Âmbito de Aplicação:

Sequenciação de Sanger está tipicamente envolvido em projetos de sequenciação de menor escala, como a sequenciação de genes individuais ou regiões específicas de DNA. NGS as tecnologias encontram amplas aplicações em vários domínios, incluindo genómica, transcriptómica e epigenómica, permitindo o sequenciamento de DNA em larga escala, aprofundado e de alta resolução.

Análise de Dados:

O volume de dados modesto torna a análise relativamente simplista para Sequenciação de SangerNo entanto, o volume de dados gerado substancialmente maior por NGS normalmente requer ferramentas e algoritmos de bioinformática intrincados para processamento e interpretação.

Tabela 1 Comparação das vantagens e desvantagens do sequenciamento Sanger e NGS

Cada uma dessas abordagens de sequenciação, incluindo Sequenciação de Sanger, sequenciação de nova geraçãoe a sequenciação de terceira geração tem as suas vantagens e desvantagens únicas. É aconselhável selecionar o método que melhor se adequa ao objetivo da pesquisa e à amostra em estudo.

Referências:

1. Crossley BM, Bai J, Glaser A, et al. Diretrizes para sequenciação Sanger e monitorização de ensaios moleculares. Revista de Investigação Diagnóstica VeterináriaNov 2020;32(6).
2. Mardis ER. Tecnologias de sequenciação de DNA: 2006–2016. Protocolos da Natureza. Fevereiro de 2017;12(2).
3. Saini M K, Gaurav H B, Kumar J, et al. Técnicas de Sequenciação de DNA: Sanger à Sequenciação de Nova Geração. DNA, 2023, 3(09): 2378-2393.
4. Crossley B M, Bai J, Glaser A, et al. Diretrizes para sequenciação Sanger e monitorização de ensaios moleculares. Revista de Investigação Diagnóstica Veterinária, 2020, 32(6): 767-775.