Sequenciação de DNA

O que é o DNA?

O DNA, entrelaçado numa estrutura de dupla hélice que se assemelha a uma escada em espiral, serve como o material genético fundamental em todos os organismos vivos. Composto por quatro letras químicas—adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C)—este script molecular entrelaça 6 mil milhões de letras (3 mil milhões de bases), encapsulando a totalidade da informação da vida.

O ácido desoxirribonucleico (DNA) é um ácido nucleico crucial, transportando as instruções genéticas vitais para a síntese de RNA e proteínas nas células vivas. Surge como uma biomolécula indispensável para o desenvolvimento e funcionamento adequado dos organismos. A sequência de bases nos nucleótidos do DNA forma a base da informação genética. Esta informação passa por transcrição para criar RNA e, subsequentemente, o mRNA dentro dele passa por tradução para gerar polipeptídeos, que constituem proteínas.

A replicação do DNA, um processo que precede a divisão celular, assegura a preservação da informação genética, evitando a sua perda ao longo das gerações. Em eucariotos, o DNA reside em estruturas denominadas cromossomas dentro do núcleo. Em organismos que não possuem núcleo, o DNA está presente em cromossomas ou outros tecidos (as bactérias apresentam moléculas de DNA de dupla hélice em laço único, enquanto os vírus possuem genomas de DNA ou RNA). Proteínas da cromatina, como histonas e coesinas, desempenham um papel fundamental na manutenção da estrutura ordenada do DNA dentro dos cromossomas. Estas estruturas orquestram a interação entre o código genético e as proteínas responsáveis pela transcrição, exercendo controle sobre a transcrição dos genes.

Por que envolver-se em sequenciação de DNA?

• A sequenciação de DNA serve para desvendar as complexidades da vida, explorar as distinções entre organismos e aprofundar-se nas histórias evolutivas e de desenvolvimento de diversas formas de vida.
• Esta técnica científica desempenha um papel fundamental na orientação da análise de DNA recombinante.
• Além disso, a sequenciação de DNA tem uma importância prática significativa no diagnóstico de doenças e genotipagem.

O que é o sequenciamento de DNA?

A tecnologia de sequenciação de DNA está na vanguarda da genómica e ocupa um lugar entre as tecnologias mais amplamente utilizadas e cruciais nas ciências da vida contemporâneas.

Em 1953, Watson e Crick não apenas revelaram a estrutura de dupla hélice do DNA, mas, mais significativamente, sublinharam a importância da sequenciação para decifrar a sequência de bases nas moléculas de DNA.

A evolução da tecnologia de sequenciadores passou por quatro estágios distintos e alcançou quatro avanços, progredindo de "leitura pré-direta" para "leitura direta", de processos manuais para automação, de métodos baseados em placas para eletroforese em gel capilar (marcando a realização inicial do sequenciamento em grande escala) e, finalmente, avançando para sequenciamento massivamente paralelo.

4 Marcos na Tecnologia de Sequenciação de DNA

Primeiro Avanço: Leitura Direta

• Leitura Pré-Direta: O método de sequenciação original que precedeu a leitura direta envolvia técnicas como clonagem molecular, PAGE e autoradiografia radiográfica.
• Método SBC: Uma reação de degradação química que utiliza reagentes específicos para degradar diretamente moléculas de DNA. Gilbert recebeu o Prémio Nobel de Química em 1980 por ter inventado o método SBC.
• Método SBS: Baseado na reação de síntese enzimática e na síntese de DNA, também conhecido como o Método de Sanger ou método de terminação terminal de ácido desoxirribonucleico duplo. Este método oferece vantagens como reagentes não tóxicos, facilidade de operação, resultados estáveis, alta precisão e excelente reprodutibilidade.

Segundo Avanço: Automação

• Pioneiros da Sequenciação Automática: Akiyoshi Wada, Wilhelm Ansorge.
• A grande inovação na automação do método SBS surgiu com a invenção do sequenciador SBS automatizado de quatro cores com fluorescência por Leroy Hood. Esta inovação teve um papel crucial no apoio e lançamento do Projeto Genoma Humano (PGH).

Terceiro Avanço: Escala-Up

• A emergência e o aprimoramento da tecnologia de sequenciação por eletroforese capilar facilitaram a ampliação.
• Em 1998, a ABI introduziu o sequenciador capilar ABIPrism 3700 (ABI3700), permitindo a escalabilidade direta da tecnologia de sequenciamento. A introdução subsequente da série de sequenciadores MegaBACE contribuiu significativamente para a conclusão precoce do HGP.

Quarta Inovação: Sequenciação Paralela em Massa

Isto representa um salto substancial em frente, caracterizado pela capacidade de sequenciar DNA de uma forma massivamente paralela, resultando numa análise rápida e simultânea de múltiplos fragmentos. Uma das principais características do sequenciamento é a sua contribuição significativa para a queda acentuada nos custos de sequenciamento.

Tipos de Tecnologias de Sequenciação de DNA

• Sequenciação de Sanger

A era inicial da tecnologia de sequenciação de DNA baseou-se na técnica de terminação de cadeias, introduzida por Sanger e Coulson em 1975, ou no método químico que envolve a degradação de cadeias, pioneiro por Maxam e Gilbert em 1976-1977. Estas técnicas são frequentemente agrupadas como o método de Sanger por uma questão de simplicidade. Um momento crucial ocorreu em 1977, quando Sanger determinou com sucesso a primeira sequência genómica—especificamente, a do fago phiX-174, composta por apenas 5.375 bases.

Por favor, leia o nosso artigo:

Sequenciação de Sanger: Introdução, Fluxo de Trabalho e Aplicações.

Perguntas e Respostas sobre Sequenciamento Sanger

• Sequenciação de Nova Geração (NGS)

Com a contínua evolução e melhoria dos projetos genómicos, o sequenciamento de primeira geração enfrentou limitações em termos de capacidade, velocidade e custo, tornando-o inadequado para sequenciação em grande escala exigências como sequenciação profunda e sequenciação de repetições. Para enfrentar esses desafios, o surgimento da sequenciação de nova geração marcou um marco transformador. Ao longo de mais de uma década de evolução tecnológica e dinâmicas de mercado, tecnologias pioneiras como Roche454 e ABI Solid, que outrora brilharam intensamente, foram gradualmente descontinuadas.

Por favor, leia o nosso artigo: O que é Sequenciação de Nova Geração (NGS)?

Atualmente, a paisagem é dominada por fabricantes de equipamentos de NGS convencionais, incluindo as séries Nextseq e MiniSeq da Illumina (reconhecidas como a plataforma de NGS convencional global) e as séries MGISEQ e os sequenciadores DNBSEQ da UWM. Notavelmente, a plataforma de NGS da UWM continua a manter uma posição competitiva.

O avanço e a adoção generalizada dessas tecnologias aceleraram significativamente os esforços de pesquisa em reessequenciação do genoma, sequenciação de genoma em larga escala, Sequenciação de metilação de DNA, sequenciação do transcriptoma, sequenciação de regiões genómicas alvodetecção de modificações epigenéticas de genes, identificação microbianae muito mais. Notavelmente, estas inovações abordaram de forma eficaz os desafios impostos pelo elevado custo e baixo rendimento associados às tecnologias de sequenciação de primeira geração. A sua ampla aplicação estende-se ao diagnóstico de patógenos, medicina de precisão, testes clínicos e patologia molecular, marcando um impacto transformador em diversos campos.

• Sequenciação de Longa Leitura

Nos últimos anos, os investigadores têm sido pioneiros no desenvolvimento da terceira geração de tecnologia de sequenciação—sequenciação em tempo real de moléculas únicasEsta abordagem inovadora visa extrair informações de sequências de DNA com maior precisão e eficiência. Ao contrário de seus predecessores, esta tecnologia elimina a necessidade de amplificação por PCR e baseia-se na deteção de sinais elétricos ou químicos de moléculas de DNA individuais, permitindo o sequenciamento de cada molécula de DNA de forma independente.

Os atuais favoritos em plataformas de sequenciação de leitura longa são Oxford Nanopore e PacBio.

• Tecnologia de Sequenciação por Nanoporos

A Oxford Nanopore Technologies apresentou sequenciação de DNA por nanoporo de molécula única, centrado na sequenciação de sinais elétricos. O princípio envolve a passagem de uma única base ou molécula de DNA através de um canal de nanoporo, causando alterações discerníveis nas propriedades elétricas do canal. As distintas propriedades químicas das bases A, T, C e G levam a variações nas alterações dos parâmetros elétricos durante a sua passagem pelo nanoporo. A deteção dessas alterações permite a determinação do tipo de base correspondente, revelando, em última análise, a sequência da fita de DNA. Notavelmente, tecnologia de nanoporos destaca-se na deteção direta de um maior número de bases, incluindo locais de metilação e diferentes aminoácidos.

• Tecnologia de Sequenciação em Tempo Real de Molécula Única (SMRT) da PacBio

Tecnologia de sequenciação PacBio RS, uma tecnologia central amplamente utilizada na sequenciação de longas leituras, baseia-se na marcação fluorescente durante a síntese. O princípio envolve a captura do molde de DNA com uma polimerase, onde quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos (dNTP) distintos marcados fluorescentemente entram aleatoriamente na área de deteção e se combinam com a polimerase através do movimento browniano. As bases que correspondem ao molde de DNA formam ligações químicas, resultando numa duração de interação mais longa em comparação com bases que não correspondem. Esta interação prolongada facilita a excitação dos dNTP marcados fluorescentemente e permite a deteção dos sinais fluorescentes correspondentes. Ao identificar os grupos fluorescentes emitidos em diferentes comprimentos de onda, pode-se determinar a espécie das bases estendidas, culminando na sequenciação do molde de DNA após o processamento da informação.