Diretrizes para Submissão de Amostras
Perguntas e Respostas sobre Sequenciação Sanger
Perguntas Gerais
- Por que é que o resultado do sequenciamento de Sanger diz que o template é promíscuo quando o ensaio de eletroforese é bom?
- Os resultados da eletroforese do produto de PCR são apenas um resultado qualitativo aproximado. Produtos de amplificação de PCR não específicos que diferem em tamanho por apenas algumas bases do fragmento alvo não podem ser distinguidos a olho nu. No entanto, Sequenciação de DNA de Sanger as reações são sensíveis e objetivas, e podem refletir diretamente o próprio modelo. Se não tiver a certeza da pureza do produto de PCR, esperamos que possa clonar o produto de PCR para garantir bons resultados de sequenciação.
- Os primers de PCR podem ser usados como primers de sequenciação Sanger?
- Os primers de PCR podem ser utilizados como primers de sequenciação Sanger, mas quanto mais longos forem os primers de PCR, menos satisfatório poderá ser o resultado da sequenciação; portanto, nem todos os primers de PCR são adequados para serem utilizados como primers de sequenciação.
- O que é uma deleção de base na Sequenciação de Sanger?
- As deleções de bases são frequentemente encontradas em produtos de PCR, especialmente em fragmentos de PCR amplificados a partir do genoma.
- Como utilizar a Sequenciação de Sanger para resolver deleções de bases?
-
(1) Continue a sequenciação utilizando primers reversos para corrigir o local da deleção e alcançar uma passagem. Alternativamente, clone o produto de PCR num plasmídeo e escolha um único clone para sequenciação.
(2) Se se puder determinar que não deve haver um local em falta neste fragmento de PCR, então as condições da reação de PCR podem ser alteradas e reamplificadas.
-
(1) Continue a sequenciação utilizando primers reversos para corrigir o local da deleção e alcançar uma passagem. Alternativamente, clone o produto de PCR num plasmídeo e escolha um único clone para sequenciação.
- Quais são os efeitos das estruturas duplicadas na Sequenciação de Sanger?
- Estruturas duplicadas levarão ao deslizamento da moldura de replicação de sequenciamento e à confusão do padrão de pico após a estrutura duplicada.
- Como usar o Sequenciamento de Sanger para resolver estruturas duplicadas?
- Sequenciar o molde com primers reversos para a estrutura duplicada completará o splicing do comprimento total do molde.
- Qual é o resultado de sequenciação Sanger da estrutura Poly?
- Tomando o polyT como exemplo, após a estrutura de polyA/T, frequentemente ocorrem deslocamentos, picos duplos e conjuntos de picos, enquanto após o polyG/C isso frequentemente leva à atenuação do sinal de sequenciação ou interrupção direta.
- Como é um gráfico de pico de sequenciação com um resultado bimodal frontal na Sequenciação Sanger?
-
(1) O produto contém um pequeno fragmento de produto de PCR.
(2) O primer tem dois locais de ligação e um dos resultados está interrompido.
-
(1) O produto contém um pequeno fragmento de produto de PCR.
- Como resolver o resultado bimodal frontal na Sequência de Sanger?
- Sequenciação reversa com um primer diferente.
- O que devo fazer se não houver sinal na Sequenciação Sanger?
- No caso de confirmar que o primer, a concentração de extração do plasmídeo, o arranjo da reação e outras condições estão corretas, se o resultado da sequenciação apresentar um padrão de pico confuso e um valor de sinal inferior a 100; então o resultado será considerado como sem sinal para sequenciação.
- Por que não consigo encontrar os primers nos resultados da Sequenciação de Sanger?
- Os resultados de sequenciamento geralmente começam a atingir o pico 30-50 bp após os primers, portanto, os primers não são encontrados nos resultados originais.
-
Quais são as causas dos sinais de sequenciação fracos na Sequenciação de Sanger?
-
(1) quantidade excessiva de template na reação de PCR de sequenciação
(2) degradação de produtos de PCR
(3) Contaminantes na amostra que inibem a atividade da DNA polimerase
-
(1) quantidade excessiva de template na reação de PCR de sequenciação
-
E se o sinal de sequenciação for fraco?
-
(1) reduzir a quantidade de template na reação de PCR de sequenciação
(2) armazenamento de produtos de PCR a 4 °C por no máximo 48 horas, sendo necessário o armazenamento a longo prazo a -20 °C.
(3) Repurifique a amostra
-
(1) reduzir a quantidade de template na reação de PCR de sequenciação
- Quais são as causas de um sinal de sequenciação forte na Sequenciação de Sanger?
- A quantidade de template na reação de sequenciação é excessiva, resultando em um sinal elevado.
-
O que devo fazer se o sinal de sequenciamento for demasiado forte?
-
(1) re-eletrofóresis capilar por diluição do produto carregado com HIDI
(2) definir um tempo de injeção mais curto
(3) reordenar a PCR e reduzir a quantidade de template na reação de sequenciação
-
(1) re-eletrofóresis capilar por diluição do produto carregado com HIDI
- Qual é a razão para o atraso na emergência do pico na Sequenciação Sanger?
-
micro-bloqueio capilar
(2) presença de impurezas no processo de eletroforese capilar
(3) Se utilizar o kit de purificação BigDye XTerminator, as microesferas na solução XTerminator entram na eletroforese capilar juntamente com o produto, resultando em alimentação anormal.
(4) Gel POP, tampão cátodo excedendo o tempo de utilização
(5) A quantidade de amostra que entra na eletroforese capilar é excessiva.
-
micro-bloqueio capilar
- O que devo fazer se houver um atraso na sequenciação de picos?
-
(1) enxaguar o tubo capilar com o preenchimento da matriz e re-capilar a eletroforese.
(2) enxaguar a bomba de gel e o tubo com a solução de lavagem e depois repetir a eletroforese capilar.
(3) re-eletroforese capilar após agitação BDX e centrifugação suficiente para permitir que as microesferas se precipitem
(4) substituir o novo gel POP, tampão do cátodo
(5) Re-capilarização da eletroforese após diluir o produto superior com HIDI ou reduzir o tempo de injeção.
-
(1) enxaguar o tubo capilar com o preenchimento da matriz e re-capilar a eletroforese.
-
Quais são as causas de sinais de sequenciação interrompidos na Sequenciação de Sanger?
-
(1) queda de sinal antes do fim da sequência A-pico final: contém sequência amplificada não específica com sinal forte e sinal fraco da sequência alvo;
(2) degradação severa do produto;
A eficiência da extensão da DNA polimerase é reduzida devido ao encontro de regiões complexas.
-
(1) queda de sinal antes do fim da sequência A-pico final: contém sequência amplificada não específica com sinal forte e sinal fraco da sequência alvo;
-
O que devo fazer se o meu sinal de sequenciação for interrompido?
-
(1) re-extrair ácidos nucleicos com aumento do tamanho da amostra e reanalisar
(2) reordenamento de PCR e purificação
(3) redesenhar novos primers ou sequenciação reversa
-
(1) re-extrair ácidos nucleicos com aumento do tamanho da amostra e reanalisar
Apenas para fins de investigação, não destinado a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.