Como Planear o Seu Próximo Experimento de Sequenciação de RNA

O que é sequenciação de RNA?

RNA-Seq, uma técnica imensamente sensível e precisa, emergiu como uma ferramenta indispensável para investigar a expressão génica e facilitou avanços significativos em várias disciplinas científicas. Enquanto métodos convencionais como microarrays apenas medem genes e transcritos conhecidos, eles não conseguem captar características novas e transcritos não identificados. Por outro lado, RNA-Seq aproveita a tecnologia de sequenciação de alto rendimento para converter amostras de RNA em sequências de DNA quantificáveis, permitindo assim que os investigadores detetem tanto características estabelecidas como novas, sem as limitações do conhecimento prévio.

Uma das vantagens distintas do RNA-Seq é a sua capacidade de identificar heterodímeros de transcritos, nomeadamente diferentes variantes de splicing originárias do mesmo gene, que podem apresentar padrões de expressão diversos em vários tecidos, estágios de desenvolvimento ou estados de doença. Além disso, o RNA-Seq permite a deteção de eventos de fusão de genes, um fenómeno comumente observado em certos tumores onde dois ou mais genes se fundem. Adicionalmente, o RNA-Seq desempenha um papel fundamental na deteção de variantes de nucleótido único (SNVs), que denotam variações em um único nucleótido dentro do genoma. Tais variantes assumem uma importância crítica na análise das disparidades genéticas entre indivíduos e na identificação de genes associados a doenças.

Ao fornecer informações de expressão em todo o transcriptoma, o RNA-Seq capacita os investigadores a desvendar mecanismos regulatórios gênicos intricados, compreender a função celular e elucidar a progressão de doenças. Além disso, o RNA-Seq facilita análises comparativas das disparidades de expressão gênica sob condições distintas, como respostas a fármacos terapêuticos e adaptações a diversos contextos ambientais.

Por favor, leia o nosso artigo. RNA-Seq para Análise de Expressão Génica Diferencial: Introdução, Protocolo e Bioinformática para mais informações.

Benefícios da sequenciação de RNA

A sequenciação de RNA (RNA-Seq) com tecnologia de sequenciação de nova geração (NGS) oferece vários benefícios para o estudo do transcriptoma:

• Amplitude dinâmica ampla: O RNA-Seq pode detectar e quantificar a expressão génica numa ampla gama de níveis de expressão, desde transcritos altamente abundantes até transcritos raros. Isso permite que os investigadores captem alterações subtis na expressão génica e identifiquem genes com baixa expressão que podem ter funções biológicas importantes.
• Medição sensível e precisa: O RNA-Seq proporciona um elevado nível de sensibilidade e precisão na medição da expressão génica. Pode detetar até pequenas alterações nos níveis de expressão génica, tornando-o adequado para várias aplicações, incluindo a análise de expressão génica diferencial e a identificação de genes expressos diferencialmente sob diferentes condições.
• Deteção de características conhecidas e novas: O RNA-Seq permite a deteção de características tanto conhecidas como novas, sem necessidade de conhecimento prévio ou de sondas pré-desenhadas. Pode identificar isoformas de splicing alternativo, fusões de genes, variantes de nucleótidos únicos, RNAs não codificantes e outras características transcriptómicas, permitindo uma exploração abrangente do transcriptoma.
• Dados qualitativos e quantitativos: O RNA-Seq gera tanto dados qualitativos como quantitativos. Ele fornece informações sobre a presença ou ausência de transcritos (qualitativos), bem como sobre a sua abundância relativa ou níveis de expressão (quantitativos). Esta dupla natureza dos dados de RNA-Seq permite que os investigadores obtenham informações tanto sobre a presença de diferentes transcritos como sobre os seus padrões de expressão.
• Cobertura completa do transcriptoma: Ao contrário dos métodos tradicionais que se concentram num número limitado de transcritos ou alvos pré-definidos, o RNA-Seq fornece uma visão abrangente de todo o transcriptoma. Captura os perfis de expressão de todos os genes transcritos, incluindo transcritos raros ou previamente não caracterizados. Esta abordagem imparcial permite uma compreensão mais aprofundada da regulação gênica e das alterações transcriptómicas.
• Aplicabilidade independente da espécie: O RNA-Seq pode ser aplicado a qualquer espécie, independentemente de existir uma sequência de referência. É particularmente útil para estudar organismos não modelo ou espécies com recursos genómicos limitados. O RNA-Seq permite a montagem de transcriptomas de novo, onde o transcriptoma é reconstruído sem depender de um genoma de referência, facilitando o estudo de espécies novas ou aquelas com genomas complexos.

A sequenciação de RNA potencia a transcriptómica.

O sequenciamento de RNA (RNA-Seq) revolucionou a pesquisa do transcriptoma em diversos campos, permitindo que os cientistas obtivessem informações valiosas sobre a expressão gênica, regulação e análise funcional. Aqui estão algumas maneiras pelas quais o RNA-Seq está a potenciar a pesquisa em transcriptómica em diferentes áreas:

• Pesquisa de doençasA RNA-Seq contribuiu significativamente para a compreensão da base molecular das doenças. Ao comparar perfis de expressão génica entre tecidos ou tipos celulares saudáveis e doentes, os investigadores podem identificar genes expressos de forma diferencial que podem desempenhar papéis-chave no desenvolvimento, progressão ou resposta ao tratamento da doença. A RNA-Seq também permite a descoberta de assinaturas transcriptómicas e biomarcadores específicos de doenças, ajudando no diagnóstico, prognóstico e medicina personalizada das doenças.
• Resposta a fármacos e farmacogenómicaA RNA-Seq permite que os investigadores estudem como as células ou tecidos respondem a tratamentos com medicamentos. Ao examinar as alterações na expressão génica após a administração de medicamentos, os investigadores podem identificar vias moleculares envolvidas na resposta ao fármaco, mecanismos de resistência ao fármaco e potenciais efeitos secundários. Além disso, a RNA-Seq pode ser utilizada para investigar as diferenças interindividuais na resposta ao fármaco, conhecidas como farmacogenómica, correlacionando perfis de expressão génica com resultados de tratamento, ajudando a orientar terapias personalizadas.

Aplicações do RNA-seq. (Hong et al., 2020)

• Biologia do desenvolvimento: O RNA-Seq é fundamental para desvendar a dinâmica da expressão génica durante várias fases do desenvolvimento. Ao comparar transcriptomas em diferentes pontos temporais de desenvolvimento, os investigadores podem identificar genes e vias envolvidos no desenvolvimento embrionário, na diferenciação de tecidos e na formação de órgãos. O RNA-Seq também pode revelar padrões de expressão espaciotemporais e redes regulatórias, fornecendo informações sobre os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento.
• Respostas ambientais: O RNA-Seq permite que os investigadores estudem como os organismos respondem a diferentes condições ambientais, como alterações de temperatura, exposição a poluentes ou disponibilidade de nutrientes. Ao analisar padrões de expressão génica, podemos identificar genes e vias envolvidos nas respostas ao stress, adaptação e sinalização ambiental. Esta informação ajuda a compreender os mecanismos moleculares das respostas ambientais e pode ter implicações em áreas como a ecologia, a agricultura e a biologia da conservação.
• Estudos de regulação genética: RNA-Seq fornece uma visão abrangente do transcriptoma, permitindo o estudo da regulação genética em diferentes níveis. Permite a identificação de eventos de splicing alternativo, detecção de RNAs não codificantese investigação da regulação pós-transcricional. Ao integrar dados de RNA-Seq com outros conjuntos de dados epigenómicos e proteómicos, os investigadores podem obter uma compreensão mais holística das redes de regulação genética e das consequências funcionais dos eventos regulatórios.

Em combinação com outras abordagens ómicas, como a genómica, epigenómica e proteómica, o RNA-Seq fornece uma ferramenta poderosa para desvendar as complexidades da expressão e regulação génica. Permite a identificação de elementos funcionais, transcritos novos, redes regulatórias e vias associadas a doenças, contribuindo, em última análise, para a nossa compreensão dos processos biológicos e da saúde humana.

Aplicações de RNA-Seqaprenda como o sequenciamento de RNA está a avançar a pesquisa do transcriptoma em várias áreas

Como aplicar métodos de sequenciação de RNA?

Os métodos de RNA-Seq oferecem diferentes vantagens e são aplicáveis a várias questões de investigação e configurações experimentais. Os investigadores podem escolher o método mais adequado com base nos seus objetivos específicos e recursos disponíveis.

• Sequenciação de mRNA: Este método permite uma quantificação sensível e precisa da expressão génica. Pode identificar isoformas conhecidas e novas no transcriptoma codificante, detetar fusões génicas e medir a expressão específica de alelos.
• Sequenciação de RNA DirecionadaEsta abordagem foca na análise da expressão génica num conjunto específico de genes de interesse. O RNA-Seq direcionado pode ser alcançado através de métodos de enriquecimento, onde os fragmentos de RNA correspondentes aos genes-alvo são enriquecidos antes da sequenciação, ou através de abordagens baseadas em amplicões, onde regiões específicas de interesse são amplificadas e sequenciadas.
• Ultra-baixo input e RNA-Seq de célula única: Este método é utilizado para examinar os sinais e o comportamento de células individuais dentro do seu ambiente circundante. É particularmente útil para estudar processos como a diferenciação celular, proliferação e tumorigenese. O RNA-Seq de ultra-baixo input permite a análise de quantidades muito pequenas de material inicial, enquanto o RNA-Seq de célula única possibilita a caracterização da expressão gênica em células individuais.
  Perguntas e Respostas sobre Sequenciação de RNA de Célula Únicaaprenda mais sobre o Sequenciamento de RNA de Célula Única.
  Sequenciação de RNA de Célula Única: Introdução, Métodos e Aplicaçõesveja como realizar o seu próximo experimento de scRNA-Seq.
• Sequenciação de RNA TotalEste método fornece uma visão abrangente do transcriptoma ao medir com precisão a abundância de genes e transcritos. Pode detetar tanto características conhecidas como novas em RNA codificante, bem como várias formas de RNA não codificante. Para mais detalhes, consulte Perguntas e Respostas sobre Sequenciação de RNA Total.
• Sequenciação de RNA pequenoEsta técnica foca na isolação e sequenciação de pequenas espécies de RNA, como os microRNAs. Ajuda a compreender o papel do RNA não codificante no silenciamento de genes e na regulação pós-transcricional da expressão genética.
• Sequenciação de LncRNAPara explorar as funções e características dos lncRNAs, utilizamos sequenciação de lncRNA em conjunto com tecnologia de sequenciação de alto rendimento e análise bioinformática.

Como analisar RNA utilizando NGS?

• Extraia RNA da amostra.
• Prepare uma biblioteca de RNA para sequenciação.
• Realize NGS para gerar leituras de sequenciação.
• Fluxo de Trabalho de Bioinformática de RNA-Seq.
• Realização de verificações de controlo de qualidade.
• Alinhamento de leituras a um genoma/transcriptoma de referência.
• Quantificação dos níveis de expressão de genes/transcritos.
• Realização de análise de expressão diferencial.
• Realização de análise funcional.
• Interprete e visualize os resultados.

Por favor, consulte As Tecnologias e Fluxo de Trabalho do RNA-Seq para ajudá-lo a determinar o processo mais apropriado para a sua pesquisa.

Referência:

1. Hong, Mingye, et al. "Sequenciação de RNA: novas tecnologias e aplicações na investigação do cancro." Revista de Hematologia e Oncologia 13.1 (2020): 1-16.