Sequenciação de RNA de Célula Única: Introdução, Métodos e Aplicações

Introdução ao sequenciamento de RNA de célula única

O sequenciamento de célula única utiliza tecnologia de sequenciamento de próxima geração (NGS) otimizada para verificar a informação de sequência de uma única célula. Existe uma maior resolução das diferenças celulares e uma melhor compreensão das funções de células individuais no microambiente. Sequenciar o RNA expresso por uma única célula pode fornecer insights sobre a existência e o comportamento de diferentes tipos de células. A população da mesma espécie parece ser geneticamente clonada, mas o sequenciamento de RNA de célula única ou o sequenciamento epigenético de célula única pode revelar a variabilidade entre células, o que pode ajudar a população a adaptar-se rapidamente ao ambiente em mudança.

O progresso e as plataformas do sequenciamento de RNA de célula única

Em 2009, o método de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) foi desenvolvido com o advento da crescente acessibilidade dos métodos de sequenciamento. O sequenciamento de RNA em massa geralmente mascara a singularidade e falha em mostrar mudanças latentes nas células. Em resposta a isso, o scRNA-seq surgiu para descobrir essa singularidade, permitindo-nos ver a biologia das células com uma resolução mais fina e detalhes definidos. Desde a sua criação, o scRNA-seq tem sido aplicado para mostrar a dinâmica dos processos de desenvolvimento, elucidar novos tipos de células, identificar a expressão gênica alélica aleatória e determinar mecanismos de regulação gênica. As plataformas comerciais incluem o Fluidigm C1, Wafergen ICELL8 e o 10X Genomics Chromium.

Figura 1. Isolamento de célula única e preparação de biblioteca. (Hwang, 2018)

Métodos de sequenciamento de RNA de célula única

Vários métodos, de comprimento total ou baseados em etiquetas, foram publicados sob scRNA-seq, onde cada protocolo oferece suas próprias vantagens e aplicabilidade. Geralmente, o scRNA-seq inclui quatro etapas: (a) isolamento e lise de células únicas ou núcleos únicos a partir da matriz extracelular e adesão célula a célula, (b) transcrição reversa que geralmente utiliza priming com oligodT para seleção de mRNAs poliadenilados e lncRNAs, (c) amplificação de cDNA utilizando os métodos SMART-seq e STRT, e (d) preparação de sequenciamento de biblioteca que é comumente realizada utilizando fragmentação baseada em transposase Tn5.

O método de sequenciamento de RNA de célula única pode ser aplicado a vários interesses de pesquisa. No desenvolvimento de órgãos, tecidos aparentemente idênticos histologicamente eventualmente se diferenciarão em várias direções, formando tipos celulares específicos com funções únicas. Através do scRNA-seq, a compreensão de programas de expressão gênica únicos que impulsionam a diferenciação e decisões de linhagem nas células melhoraria nossa compreensão do desenvolvimento inicial de órgãos. No câncer, o scRNA-seq permite-nos dissecar as múltiplas propriedades dos tipos celulares dentro e ao redor de um tumor. A análise detalhada da heterogeneidade celular dentro dos tumores primários e metastáticos sugeriu o tratamento mais apropriado para tipos celulares específicos de câncer. Quando o scRNA-seq é combinado com gravação eletrofisiológica de patch-clamp de célula inteira, dando origem ao Patch-seq, propriedades anatômicas, morfológicas e funcionais podem ser ligadas à expressão gênica.

Desafios e aplicações

Os desafios no scRNA-seq envolvem trabalhar com uma quantidade limitada de material (ou seja, mRNA); portanto, há uma necessidade de métodos de amplificação que podem não ser sempre lineares, como ter vieses e erros. A incorporação de códigos de barras moleculares à técnica scRNA-seq ajuda a superar esse problema. Capturar células únicas, a existência de ruído biológico e a análise de dados permanecem obstáculos para a tecnologia scRNA-seq.

Apesar dos desafios remanescentes, o futuro da tecnologia scRNA-seq permanece esperançoso. Ela está envolvida em transcriptômica espacial, onde o transcriptoma pode ser analisado em seções de tecido intactas montadas em lâminas, sem a necessidade de isolamento celular da matriz extracelular. Com a ajuda da microcopia/dissecação por captura a laser, o transcriptoma pode ser analisado e representar o cenário in vivo em um grau mais elevado do que outros métodos que requerem dissociação. Além disso, o scRNA-seq permite a identificação de biomarcadores e alvos de medicamentos, o que desenvolve ainda mais a medicina de precisão e a conclusão do atlas celular humano. Por último, o perfil combinado do genoma, transcriptoma e epigenoma de uma única célula deu origem a métodos como "DRseq", "scTrio-seq" e "scM&T-seq".

Referências:

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