Perfilagem de Ribossomas: Definição, Aplicações, Princípios e Fluxo de Trabalho

O que é o perfilamento de ribossomas?

Perfilagem de ribossomas, também conhecido como Ribo-seq, é uma técnica de sequenciação de alto rendimento recentemente desenvolvida, baseada na sequenciação de fragmentos de mRNA protegidos por ribossomas. O perfilamento de ribossomas permite a medição detalhada e precisa da tradução celular, mesmo in vivoA Ribo-seq permite o monitoramento dos processos de tradução celular, a determinação de proteínas ativamente traduzidas numa célula e a previsão da abundância de proteínas, ajudando assim a definir o proteoma de organismos complexos. Além disso, a Ribo-seq pode fornecer informações sobre o mecanismo da regulação da tradução. Por exemplo, pode ser utilizada para detectar pausas regulatórias na tradução e ORFs traduzidos a montante, bem como monitorar processos de tradução mediados por subconjuntos de ribossomas. O perfilamento de ribossomas é o primeiro método disponível para a anotação de quadros de leitura abertos (ORFs) traduzidos e tem possibilitado a descoberta de muitos produtos proteicos novos ou alternativos.

Aplicações do perfilamento de ribossomas:

• Identificar sequências traduzidas dentro do transcriptoma complicado.
• Mapear locais de iniciação da tradução
• Medir a expressão diferencial de genes ao nível da tradução de mRNA.
• Identificar novos genes codificadores de proteínas e a pausa do ribossoma.
• Fornecer dados para modelos quantitativos de tradução.
• Fornecer informações sobre o mecanismo de síntese de proteínas, controlo da tradução e processo de infecção viral.

Princípios da Análise de Perfis de Ribossomas

O perfilamento de ribossomas aproveita o facto de que os ribossomas envolvidos na tradução podem proteger cerca de 30 nucleotídeos de um fragmento de mRNA contra a digestão por RNAse. Esta técnica explora primeiro o método molecular clássico de impressão digital de ribossomas. Neste método, in vitro Os mRNAs traduzidos são tratados com nuclease para destruir regiões não protegidas. Os mRNAs protegidos pelo ribossoma podem ser mapeados de volta ao mRNA original para determinar a localização exata do ribossoma em tradução. O perfilamento de ribossomas estende o método de impressão digital de ribossomas ao mapear e medir o conjunto completo de impressões digitais de ribossomas para quantificar a síntese de proteínas novas e anotar regiões codificantes globalmente. Os avanços na tecnologia de sequenciação permitem uma análise profunda e precisa de todos os ribossomas em tradução através da mRNA-seq.

Fluxo de Trabalho da Análise de Perfis de Ribossomas

O perfilamento de ribossomas baseado em sequenciação de próxima geração (NGS) requer a preparação de uma amostra fisiológica, in vivo captura de ribossomas e mRNAs em tradução, lise, digestão por nucleases (tipicamente RNase I ou nuclease microcócica) para obter fragmentos protegidos por ribossomas, isolamento de ribossomas e, subsequentemente, pegadas de ribossomas, que são convertidas em uma biblioteca específica de fita e submetidas a NGS. As sequências dos fragmentos são então mapeadas contra o genoma de referência apropriado. O perfilamento de ribossomas fornece informações em todo o genoma sobre a síntese de proteínas (GWIPS) in vivo.

Ao comparar as taxas de síntese de proteínas e a abundância de mRNAs, a eficiência translacional para cada mRNA pode ser determinada.

Figura 1. Fluxo de trabalho para o perfilamento de ribossomas (Brar e Weissman 2015).

Referências:

1. Brar G A, Weissman J S. O perfilamento de ribossomas revela o quê, quando, onde e como da síntese de proteínas. Nature Reviews: Biologia Celular e Molecular, 2015, 16(11): 651-664.
2. Ingolia N T. Profilagem de ribossomas: novas perspetivas da tradução, desde códons únicos até à escala do genoma. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(3): 205-213.