Diretrizes para Submissão de Amostras
A Necessidade Crítica de Validação Genómica de Organoides
Os organoides derivados de pacientes (PDOs) revolucionaram a modelagem de doenças, a medicina personalizada e a oncologia de precisão ao preservar a arquitetura tridimensional, as interações entre células e as características funcionais dos tecidos primários. Ao contrário das linhas celulares tradicionais em 2D — que passaram décadas a adaptar-se a superfícies de plástico planas e frequentemente contêm genomas completamente alheios ao paciente original — os PDOs são aclamados como "avatares" autênticos do estado da doença humana. No entanto, a morfologia visual e a expressão de alguns marcadores de superfície, por si só, não podem garantir que um organoide continue a ser uma representação fiel da doença do paciente a nível molecular.
A investigação translacional baseia-se fortemente na suposição de que um modelo de organoide reflete o do paciente. in vivo tumor. No entanto, o estabelecimento de PDOs representa um gargalo evolutivo significativo. À medida que os organoides são estabelecidos e passados. in vitro, estão continuamente sujeitos a pressões de seleção artificial. Os fatores de crescimento específicos nos meios (por exemplo, EGF, Noggin, R-spondin) podem inadvertidamente favorecer a proliferação de células epiteliais do tipo selvagem em detrimento das células tumorais, um fenómeno conhecido como sobrecrescimento de células normais. Alternativamente, as condições de cultura podem selecionar um subclon específico e de rápido crescimento que não representa a maior parte do tumor primário heterogéneo.
Com o tempo, subclones menores podem desaparecer completamente, pode ocorrer deriva genética induzida pela cultura e, criticamente, mutações motoras passíveis de serem alvo podem ser perdidas devido ao stress replicativo e à ausência de um sistema imunitário intacto para eliminar células aberrantes.
O Sequenciamento do Exoma Total atua como o ponto de controlo de qualidade (QC) definitivo para os seus modelos. Ao perfilar toda a região codificadora—que abriga a vasta maioria das mutações conhecidas que causam doenças e que são alvo de fármacos—os investigadores podem responder de forma conclusiva:
- Confirmação de Identidade: O organoide abriga o específico KRAS, TP53, PIK3CAou EGFR mutações driver identificadas no relatório clínico do paciente?
- Heterogeneidade ClonalAs populações subclonais menores do tumor primário são preservadas na cultura 3D, ou a cultura tornou-se monoclonal?
- Estabilidade GenómicaO perfil genómico desvia-se significativamente após 10, 20 ou 30 passagens?
- Ausência de Artefatos: Surgiram mutações hiperproliferativas novas? in vitro que pode confundir os resultados?
Sem a validação do WES, os investigadores correm o risco de identificar sensibilidades a fármacos ou mecanismos de resistência que são artefatos do sistema de cultura, em vez de verdadeiros reflexos da biologia do câncer do paciente. Milhões de dólares em esforços de triagem podem ser desperdiçados se o modelo subjacente não tiver o alvo de interesse.
Design de Estudo com Amostras Emparelhadas: A Comparação em Triade
Para identificar com confiança mutações específicas de tumores, analisar o organoide de forma isolada é completamente insuficiente. Nós projetamos sequenciação do exoma completo projetos em torno de relações comparativas que subtraem com precisão o ruído de fundo herdado.
Ao avaliar um organoide derivado de paciente, o desenho de estudo padrão-ouro envolve uma "Triade" de três componentes:
- Tecido Normal Correspondente (ou Sangue)Estabelece as variantes germinativas herdadas basais do paciente. Uma vez que os genomas humanos contêm milhões de SNPs herdados benignos, uma amostra normal correspondente do mesmo paciente é crítica.
- Tecido Tumoral Primário: Define o perfil de mutação somática original (a "verdade fundamental" do câncer) antes de qualquer in vitro manipulação.
- Modelo de Organoide: Representa o estabelecido in vitro cultura a ser avaliada.
Ao sequenciar os três componentes simultaneamente, os nossos avançados pipelines de bioinformática conseguem filtrar com precisão as variantes germinativas. Isso previne chamadas de mutações somáticas com falsos positivos. Por exemplo, sem um normal emparelhado, um SNP herdado raro pode ser erroneamente classificado como um novo condutor específico do tumor. Os nossos pipelines utilizam modelos estatísticos complexos (como algoritmos de genotipagem somática bayesiana) para comparar as frequências alélicas entre as amostras normais, tumorais e de organoides, garantindo que apenas mutações adquiridas verdadeiras sejam reportadas.
Se o tecido normal correspondente não estiver absolutamente disponível (o que é comum em amostras de biobanco adquiridas comercialmente), podemos empregar estratégias de chamada apenas de tumor. Estas estratégias utilizam grandes bases de dados populacionais (por exemplo, dbSNP, gnomAD, 1000 Genomes Project) juntamente com painéis de normais (PoN) para filtrar variantes germinativas comuns e raras. Embora eficaz, esta abordagem limita inerentemente a certeza absoluta da confirmação de variantes somáticas em comparação com o design Triad.
Principais Aplicações na Investigação Translacional
Os nossos serviços de WES de Organoides suportam um amplo espectro de aplicações avançadas de investigação translacional e pré-clínica:
- Validação e Certificação de Biobanco de OrganoidesAntes de distribuir PDOs para estudos em larga escala ou comercialização, os biobancos devem caracterizar rigorosamente os seus modelos. O WES fornece a certificação genómica padrão de que um modelo reflete com precisão o tecido doador.
- Correlações entre Farmacogenómica e Triagem de MedicamentosA WES permite que os investigadores correlacionem alterações genómicas específicas (por exemplo, mutações de Deficiência em Recominação Homóloga [HRD] como BRCA1/2) com a resposta do organoide a terapias direcionadas (por exemplo, inibidores de PARP), garantindo que o mecanismo de ação do fármaco corresponda ao genótipo do modelo.
- Modelagem da Resistência Terapêutica Adquirida: Ao sequenciar longitudinalmente organoides antes do tratamento, durante o tratamento e após o surgimento da resistência in vitroos investigadores podem identificar mutações exónicas recém-adquiridas que conferem resistência a medicamentos, imitando a recaída clínica.
- Estudos sobre Evolução Tumoral e Heterogeneidade EspacialOs investigadores podem realizar amostragem multi-região de um tumor primário e estabelecer linhagens de organoides distintas a partir dessas regiões específicas. O mapeamento de WES dessas linhagens ajuda a modelar a heterogeneidade espacial e a evolução clonal. in vitro.
- Modelos "Avatar" Pré-Clínicos para Ensaios Co-ClínicosEm configurações de ensaios co-clínicos, avatares de pacientes (PDOs) são tratados com medicamentos em paralelo com o paciente. A WES confirma que o avatar mantém as mutações específicas alvo que impulsionam a resposta clínica do paciente.
Fluxo de Trabalho WES de Ponta a Ponta para Organoides
O manuseamento de culturas de organoides 3D requer uma especialização específica para superar desafios únicos, como contaminação da matriz extracelular (MEC), núcleos necróticos e baixos rendimentos celulares. O nosso fluxo de trabalho de laboratório está fortemente otimizado para maximizar a qualidade dos dados a partir de entradas limitadas e complexas.
O nosso fluxo de trabalho WES abrangente inclui pontos de controlo de QC críticos para garantir a chamada de variantes somáticas de alta qualidade a partir de modelos de organoides.
Receção de Amostras e Extração de DNA Sem Matriz:
- Aceita organoides vivos, pellets congelados ou DNA genómico pré-extraído.
- A remoção completa de Matrigel, BME ou hidrogéis sintéticos é absolutamente crítica. Proteínas de matriz residuais inibem reações enzimáticas.
- Ponto de Controlo de QCConcentração de DNA (Qubit), pureza (NanoDrop) e integridade (DIN > 7 via TapeStation).
Preparação Avançada de Bibliotecas e Captura de Exoma:
- O DNA de alta qualidade é fragmentado em 150-250 bp utilizando cisalhamento acústico (Covaris) ou enzimas.
- Adaptadores com índices duplos únicos (UDIs) são ligados para minimizar a troca de índices.
- Hibridização com sondas de captura de exoma líderes de mercado (Agilent SureSelect XT HS2 ou Twist Bioscience) direcionadas a regiões codificantes, UTRs e sequências intrónicas adjacentes.
Estratégia de Sequenciamento Ultra-Profundo:
- Sequenciado em plataformas de ponta da Illumina (NovaSeq X Plus, PE150).
- 100X de profundidade para amostras normais, ≥200X a 500X de profundidade para tumores primários e organoides.
- O sequenciamento profundo garante a deteção robusta e estatisticamente significativa de subclones raros (VAF < 10%).
Análise Bioinformática Avançada de Triade:
- Filtragem de qualidade e alinhamento ao genoma de referência humano (hg38) usando BWA-MEM.
- Chamadas de variantes em conjunto utilizando algoritmos de topo (GATK Mutect2, Strelka2, VarScan2) para chamadas precisas.
- Anotação funcional abrangente de SNVs e InDels.
Se está apenas a começar o seu projeto, o nosso serviços de desenvolvimento de modelos organoides pode ajudar a coordenar a recolha e o armazenamento de tecidos normais e tumorais correspondentes juntamente com os seus organoides.
Análise Bioinformática Especializada para PDOs
Não fornecemos apenas uma lista bruta de mutações; oferecemos uma estrutura analítica comparativa que responde diretamente se o seu modelo é adequado para o seu propósito de investigação específico. Os nossos produtos de bioinformática são concebidos para estarem prontos para publicação.
Características Padrão do Pipeline
- Anotação de VariantesUtilizando ClinVar, COSMIC, dbNSFP e SIFT/PolyPhen para prever impactos funcionais.
- Análise de Concordância GenómicaCálculos do índice de similaridade de Jaccard e diagramas de Venn para quantificar a sobreposição somática exata entre o tumor primário e o organoide.
- Avaliação de Correlação VAFGráficos de dispersão a comparar as Frequências de Alelos Variantes para revelar se certos subclones foram enriquecidos ou depletados durante a cultura.
Módulos Avançados Opcionais
- Análise de Assinatura MutacionalExtração de assinaturas COSMIC para determinar se os processos mutacionais fundamentais são mantidos. in vitro.
- Inferência de CNV Baseada em Exoma: Utilizando ferramentas como CNVkit ou EXCAVATOR2 para inferir Variações de Número de Cópias direcionadas (por exemplo, HER2/ERBB2 amplificações ou PTEN deleções) diretamente da cobertura WES.
- Pontuação TMB e MSIEstimativa precisa da Carga Mutacional Tumoral e do estado de Instabilidade de Microssatélites diretamente a partir de dados de exoma.
- Subtração de Leitura de Rato (Verificação de Xenógrifo): Utilizando in silico ferramentas como o Xenome para mapear leituras tanto para genomas de referência humano quanto de rato, subtraindo de forma limpa a contaminação de DNA de rato de modelos derivados de PDX.
Para a integração fenotípica, considere acoplar isto com o nosso serviços de caracterização de organoides.
Requisitos e Diretrizes de Preparação de Amostras
A preparação adequada das amostras dita o sucesso final da captura e sequenciação da biblioteca. Organoides embebidos em extratos de membrana basal requerem manuseio cuidadoso para evitar falhas analíticas a montante. Além disso, organoides grandes frequentemente desenvolvem núcleos necróticos que podem libertar DNA degradado, impactando negativamente a complexidade da biblioteca.
| Tipo de Amostra | Entrada Mínima | Preparação e Envio | Consideração Chave |
|---|---|---|---|
| DNA genómico | ≥ 500 ng | Envie em gelo seco. Tampão sem EDTA (por exemplo, 10mM Tris). | O gDNA não deve apresentar degradação significativa (DIN > 7). Evite múltiplos ciclos de congelação-descongelação. |
| Pelote de Organoide | 1×10^6 células | Lave cuidadosamente com PBS frio ou Solução de Recuperação Celular. Congele rapidamente e envie em gelo seco. | A remoção de matriz incompleta inibe drasticamente a lise celular e a extração. Para organoides grandes, recomenda-se uma dissociação suave para lavar os detritos do núcleo necrótico. |
| Tumor Primário | > 10 mg de tecido | Congelar imediatamente após a resseção ou biópsia. Enviar em gelo seco. | A celularidade tumoral deve ser avaliada histologicamente; um alto conteúdo necrótico ou estromal reduz a sensibilidade à deteção de variantes. |
| Normal Correspondente | > 10 mg de tecido ou 2 mL de sangue | Congelar rapidamente o tecido adjacente normal ou enviar sangue em tubos de EDTA. | Essencial para a chamada precisa de variantes somáticas. O tecido adjacente deve ser histologicamente confirmado como livre de infiltração tumoral. O sangue é preferido. |
Seleção de Estratégia: WES vs. WGS vs. RNA-Seq vs. Painéis Alvo
Selecionar a modalidade de sequenciação correta garante que você responda à sua questão biológica sem ultrapassar o seu financiamento ou orçamento.
- Sequenciamento do Exoma Completo (WES): Melhor para descobrir e validar mutações somáticas na região codificadora (SNVs e InDels), confirmar mutações condutoras, identificar novas mutações codificadoras e acompanhar a evolução clonal em alta profundidade. Altamente rentável para grandes biobancos. Não para identificação de grandes variações estruturais em regiões não codificantes.
- Sequenciação do Genoma Completo (WGS): Melhor para mapeamento abrangente de todo o genoma, incluindo elementos intrónicos profundos e regulatórios. Não para validação de alto rendimento em rotina com um orçamento limitado, devido ao alto custo de 200X a 500X de cobertura em todo o genoma.
- Painéis Genéticos Alvo: Melhor para sequenciação ultra-profundas (1000X+) de um pequeno conjunto pré-definido de genes cancerígenos conhecidos para rastrear motores específicos conhecidos. Não para descobrir mutações novas fora do painel ou avaliar de forma abrangente a deriva genómica geral.
- Sequenciação do Transcriptoma (RNA-Seq): Melhor para medição da expressão gênica ativa e identificação de fusões através do nosso soluções de pesquisa em organoides. Não para chamando com precisão mutações a nível de DNA devido à edição de RNA, degradação mediada por nonsense e um viés de expressão massivo.
Referências:
- Luo Z, Wang B, Luo F, et al. Estabelecimento de um biobanco de organoides de adenoma colorretal de alto risco, derivados de pacientes, em grande escala para triagem de fármacos de alto rendimento e alto conteúdo. BMC Medicina. 2023;21:336. Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. No entanto, posso ajudar a traduzir texto que você fornecer. Por favor, cole o texto que deseja traduzir.
- Ahn S-J, Lee S, Kwon D, et al. Diretrizes Essenciais para a Fabricação e Aplicação de Organoides. Revista Internacional de Células-Tronco2024;17(2):102-112. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei prazer em ajudar com a tradução.
Apenas para uso em investigação. Não para uso em procedimentos de diagnóstico, tomada de decisões clínicas, estratificação de pacientes, seleção terapêutica ou ensaios clínicos.
Formatos de Resultados Ilustrativos
Os seguintes visuais planeados explicam as estruturas de entregáveis comuns fornecidas nos nossos relatórios de fidelidade genómica de organoides. São exemplos ilustrativos que demonstram formatos de dados, não dados reais de pacientes.
Análise de Sobreposição de Mutação Somática
Um requisito fundamental para a validação de organoides é demonstrar exatamente quantas mutações somáticas são partilhadas. Um diagrama de Venn de três vias ilustra claramente a interseção de variantes identificadas no Tumor Primário, no Modelo de Organoide e no Normal Correspondente. Um modelo de alta fidelidade mostra uma sobreposição substancial de mutações somáticas específicas do tumor, com muito poucas variantes "Únicas do Organoide" (indicando um desvio induzido pela cultura mínimo).
Correlação da Frequência do Alelo Variável
Manter a proporção de células com uma mutação é crucial para preservar a heterogeneidade tumoral. Um Gráfico de Dispersão de VAF mapeia a frequência de cada mutação no tumor primário em relação à sua frequência no organoide. As mutações que caem ao longo da diagonal indicam uma preservação clonal perfeita. Variantes que se desviam fortemente em direção ao eixo Y representam subclones menores que se expandiram rapidamente durante in vitro cultura.
Perfilagem de Assinaturas Mutacionais
Os genomas do câncer são moldados por processos mutacionais subjacentes. Ao analisar a frequência de 96 possíveis alterações no contexto de trinucleotídeos, extraímos assinaturas mutacionais COSMIC estabelecidas a partir dos dados do exoma. Comparar o perfil de assinatura do tumor com o do organoide confirma se os motores biológicos fundamentais da instabilidade genómica (por exemplo, HRD, defeitos na reparação de desajustes) permanecem ativos no modelo 3D.
FAQs sobre WES de Organoides
1. Por que é que o tecido normal emparelhado é tão crítico? Não se pode simplesmente usar o dbSNP?
Embora bases de dados populacionais como dbSNP, gnomAD e o Projeto dos 1000 Genomas contenham milhões de variantes humanas comuns, não incluem todas as mutações herdadas privadas, raras ou específicas de família. Sem uma amostra normal correspondente (como sangue ou tecido saudável adjacente) do paciente específico, é quase impossível provar de forma definitiva que uma nova variante encontrada no organoide é uma verdadeira mutação tumoral somática adquirida e não uma característica germinativa rara herdada.
2. Quão profundo devo sequenciar os meus organoides?
Para a análise padrão da linha germinativa, uma profundidade de 100X é tipicamente suficiente. No entanto, os tumores e os seus organoides derivados são altamente heterogéneos. Uma mutação crítica de impulso ou um subclon raro resistente a fármacos pode estar presente apenas em 5% das células. Para detectar de forma fiável estas variantes subclonais de baixa frequência (VAF < 10%) com confiança estatística, recomendamos fortemente sequenciar as amostras de tumor e organoide a uma profundidade de 200X a 500X.
3. O Matrigel interfere com o WES?
Sim. Matrigel e outros extratos de membrana basal são matrizes extracelulares ricas em proteínas que podem aprisionar células, bloquear soluções de lise e inibir as enzimas utilizadas durante a extração de DNA e a preparação de bibliotecas. Os organoides devem ser cuidadosamente recuperados da matriz utilizando lavagens com PBS frio ou soluções especializadas de recuperação celular (como a Solução de Recuperação Celular Corning) antes de serem centrifugados e congelados, para garantir um alto rendimento e qualidade de DNA.
4. O WES consegue detetar Variações no Número de Cópias (CNVs) e Amplificações de Genes?
O WES é principalmente projetado para detectar variantes pequenas (SNPs e InDels) em regiões codificantes. No entanto, através de ferramentas de bioinformática especializadas (como CNVkit ou EXCAVATOR), podemos inferir CNVs direcionados comparando a profundidade de cobertura de leitura entre os exões alvo entre a amostra tumoral/organoide e a amostra normal. Isso é altamente eficaz para detectar ampliações massivas (por exemplo, HER2 amplificação em organoides mamários). Note que o WES não consegue mapear de forma fiável os pontos de ruptura de variantes estruturais ou rearranjos em grande escala em regiões não codificantes; é necessário o Sequenciamento de Todo o Genoma (WGS) para essas aplicações.
5. Quantas passagens são demais? Quando devo re-sequenciar os meus organoides?
A estabilidade genómica varia bastante dependendo da origem do tecido, das mutações específicas presentes (por exemplo, tumores deficientes em reparação de desajustes apresentam uma deriva muito mais rápida) e das pressões seletivas dos meios de cultura. Geralmente, os organoides são considerados "de passagem inicial" e mais estáveis entre as passagens 1 a 10. Recomendamos sequenciar organoides de passagem inicial para validação inicial e realizar re-sequenciamento periódico (por exemplo, a cada 10-15 passagens) se o modelo for mantido em cultura contínua a longo prazo para monitorizar a deriva genética.
6. Você apoia organoides de rato ou de outros organismos não humanos?
Sim. Embora os PDOs humanos sejam os mais comuns, os nossos serviços de WES e kits de captura de exoma são totalmente compatíveis com organoides derivados de ratos (modelos murinos), modelos caninos e outras espécies mamíferas amplamente estudadas. Por favor, consulte a nossa equipa sobre os genomas de referência específicos e os kits de captura disponíveis para a sua espécie de interesse.
7. Posso submeter amostras de tumor primário FFPE para comparar com os meus organoides vivos?
Sim, aceitamos tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPE). No entanto, a fixação em formalina causa ligações cruzadas de DNA, fragmentação severa e introduz artefatos de sequenciação (especificamente transições C>T causadas pela desaminação de citosina). Empregamos protocolos especializados de extração de DNA de FFPE e reparo enzimático (por exemplo, tratamento com UDG) para mitigar isso, mas o tecido fresco congelado é sempre altamente preferido quando disponível para a comparação de maior qualidade.
8. Em que formato os dados são entregues e quanto tempo demora?
O tempo de resposta depende do projeto, com base no volume de amostras, requisitos de preparação e profundidade de sequenciação. Os dados são entregues de forma segura através de download na nuvem ou disco rígido físico. Você receberá arquivos FASTQ brutos, arquivos BAM alinhados, VCFs anotados e um relatório abrangente em PDF de bioinformática contendo todas as métricas de QC, tabelas e gráficos visuais.
9. Os dados de WES podem ser utilizados para desenhar painéis personalizados direcionados para triagens posteriores?
Absolutamente. Muitos investigadores utilizam os nossos serviços de WES no tumor primário e em organoides de passagem inicial para descobrir as mutações somáticas específicas derivadas do paciente. Podemos então usar esses dados para ajudar a conceber um painel de Amplicon ou Capture ultra-direcionado e personalizado (por exemplo, 50 mutações específicas). Você pode então usar este painel personalizado, muito mais barato, para rastrear rapidamente centenas de clones de organoides a jusante ou acompanhar as mutações ao longo do tempo durante o tratamento com medicamentos.
10. Como lida com a contaminação de células de rato se o meu organoide foi derivado de um modelo PDX?
Os organoides estabelecidos a partir de Xenotransplantes Derivados de Pacientes (PDX) muitas vezes contêm células estromais de rato. Se sequenciados diretamente, o DNA de rato será mapeado de forma ambígua ao genoma humano, causando um grande número de chamadas de variantes falsas-positivas. Utilizamos especializados in silico ferramentas (como o Xenome) para mapear todas as leituras de sequenciamento tanto aos genomas de referência humano como de rato simultaneamente. Identificamos e descartamos inequivocamente as leituras de rato, garantindo que a chamada de variantes seja realizada exclusivamente no DNA do organoide humano.
Estudos de Caso: Validação da Fidelidade Genómica para Aplicações de Alto Rendimento
Estudo de Caso 1: Validação de uma Biobanco de Organoides de Adenoma Colorretal
Fundo
O estabelecimento de biobancos em grande escala é crítico para testes farmacológicos de alto rendimento. No entanto, antes que um biobanco possa ser considerado fiável para triagem de medicamentos, o in vitro os modelos devem ser rigorosamente validados para garantir que recapitulem a paisagem genética dos tecidos originais dos pacientes. Numa abrangente estudo de 2023, os investigadores procuraram construir uma biobanco vivo de organoides de adenomas colorretais de alto risco para estudar a predisposição ao câncer e a resposta a medicamentos.
Metodologia
Para provar a fidelidade dos seus modelos, os investigadores isolaram DNA genómico dos tecidos de adenoma primário, dos organoides de passagem precoce correspondentes e do tecido normal do paciente emparelhado (para servir como controlo germinativo). Realizaram Sequenciamento de Exoma Completo (WES) utilizando um design Triad emparelhado. O sequenciamento foi realizado a uma profundidade elevada para garantir que até mesmo variantes subclonais raras fossem detetadas. O pipeline bioinformático utilizou as Melhores Práticas do GATK para filtragem germinativa, seguido pela chamada de variantes somáticas para identificar SNPs e InDels específicos.
Resultados
Os dados comparativos do WES revelaram uma notável concordância genómica. Os organoides mantiveram fielmente a vasta maioria das mutações somáticas presentes nos adenomas parentais. Crucialmente, mutações específicas predisponentes ao câncer na via Wnt/β-catenina (por exemplo, APC mutações) e a via PI3K/AKT estavam perfeitamente preservadas no in vitro culturas. Além disso, ao calcular a carga mutacional e comparar as Frequências Alelicas Variantes (VAFs), a equipa demonstrou que a arquitetura clonal dos adenomas permaneceu altamente estável ao longo do passamento inicial, sem acumulação significativa de artefatos induzidos pela cultura.
Conclusão
Ao ancorar a validação do seu modelo com WES de alta profundidade, a equipa de investigação provou de forma definitiva que os organoides de adenoma colorretal eram representações geneticamente precisas da doença primária. Esta certificação genómica permitiu-lhes avançar com confiança para triagens de fármacos de alto rendimento e alto conteúdo, sabendo que os seus resultados seriam biologicamente relevantes para a patologia dos pacientes.
Pesquisa independente caracterizando organoides de adenoma derivados de pacientes. Adaptado de Luo Z, et al. (2023), BMC Medicina. Fonte: Estabelecimento de um biobanco de organoides de adenoma colorretal de alto risco derivados de pacientes em grande escala... O estudo publicado foi independente da CD Genomics.
Estudo de Caso 2: Acompanhamento da Dinâmica Clonal em Organoides de Adenocarcinoma Ductal Pancreático (PDAC)
FundoO adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é notório pelo seu estroma denso e pela complexa paisagem mutacional. Os investigadores que desenvolvem organoides de ADP frequentemente têm dificuldades em confirmar se as suas culturas representam as verdadeiras células epiteliais malignas ou apenas células ductais normais que superaram as células tumorais. in vitro.
MetodologiaUm grupo de pesquisa submeteu amostras Triad correspondentes a pacientes (sangue, tumor primário de PDAC e organoides de passagem 5) à CD Genomics para WES de alta profundidade (cobertura de 300X). O objetivo era confirmar a identidade maligna e avaliar se o KRAS e SMAD4 as mutações identificadas na biópsia clínica do paciente foram retidas.
ResultadosO pipeline WES filtrou com sucesso mais de 40.000 variantes germinativas herdadas. A chamada de variantes somáticas identificou o exato KRAS mutação condutora G12D no modelo de organoide. Curiosamente, a análise de correlação do VAF revelou que um subclono menor portava um SMAD4 a deleção (presente apenas em 8% VAF no tumor primário) tinha expandido para 65% VAF na cultura de organoides, indicando uma forte in vitro vantagem de seleção para esta subpopulação específica.
ConclusãoWES não apenas certificou a identidade maligna do organoide PDAC (provando que não era um crescimento de tecido normal), mas a análise subclonal profunda revelou uma expansão clonal dinâmica. Os pesquisadores puderam ajustar a sua interpretação da triagem de medicamentos, sabendo que o seu modelo estava fortemente enriquecido para o SMAD4subclonagem deficiente.