Fluxo de Trabalho de Sequenciação de LncRNA e Sua Análise de Dados

Introdução ao sequenciamento de LncRNA

LncRNA é um RNA não codificante com mais de 200 nucleotídeos de comprimento. Comparado com o mRNA, o lncRNA é geralmente de expressão baixa e tem uma especificidade tecidual mais forte. Como um ponto focal da pesquisa em RNA, lncRNA regula a expressão de genes codificadores em vários níveis, incluindo herança epigenética, transcrição e pós-transcrição. Diferente da inspeção tradicional por chip, a análise de lncRNA combinada com tecnologia de sequenciação de alto rendimento e análise bioinformática pode escavar de forma abrangente a informação de lncRNA nas amostras. Sequenciação de LncRNA A tecnologia tem sido amplamente utilizada na melhoria genética de espécies e em estudos de doenças sobre ocorrência, desenvolvimento, diagnóstico e tratamento.

Sequenciação de RNA não codificante longo (lncRNA) envolve sequenciação de alto rendimento de uma classe de RNAs não codificantes produzidos dentro das células com um comprimento superior a 200 nucleotídeos. A construção da biblioteca é realizada utilizando um método que elimina o RNA ribossómico (rRNA), seguido da implementação de tecnologias de sequenciação de alto rendimento, suportadas por uma plataforma robusta de análise bioinformática. Esta abordagem permite estudos abrangentes e aprofundados de todos os lncRNAs conhecidos ou novos presentes numa amostra específica.

A utilização da construção de bibliotecas específicas de fita para lncRNAs confere à abordagem certas vantagens em relação às técnicas convencionais de construção de bibliotecas de transcriptoma. A principal entre estas é que o sequenciamento específico de fita pode estabelecer a direcionalidade transcricional das duas fitas de RNA, reduzindo assim os erros durante o processo de alinhamento. Além disso, o sequenciamento de bibliotecas de lncRNA produz informações mais ricas. A construção de uma biblioteca de lncRNA é realizada no âmbito de mRNA + lncRNA, de modo que uma única ronda de construção de biblioteca resulta simultaneamente em dados relativos a ambos. mRNA e lncARNs.

O Fluxo de Trabalho da Sequenciação de LncRNA

Um típico sequenciação de lncRNA inclui a avaliação da qualidade do RNA total, preparação da biblioteca e sequenciação. Desde a amostra de RNA até os dados finais, cada etapa tem um impacto na qualidade e quantidade dos dados. Portanto, obter dados de alta qualidade é a premissa para garantir uma análise abrangente e credível das informações biológicas.

Figura 1. Visão geral do sequenciamento de lncRNA.

Deteção de RNA total: Inclui principalmente a análise do grau de degradação do RNA e contaminação, deteção da pureza do RNA (razão OD260/280), quantificação precisa da concentração de RNA (Qubit) e deteção da integridade do RNA.

Construção de biblioteca: Após a qualificação do RNA total para a preparação da biblioteca, a base de poli-A mRNA A enriquecimento seguido pela fragmentação de mRNA é realizado para reduzir as leituras de rRNA. Em seguida, o cDNA é sintetizado a partir do RNA enriquecido e fragmentado utilizando transcriptase reversa (Super-Script II) e primers aleatórios. O cDNA é posteriormente convertido em DNA de cadeia dupla utilizando a solução tampão, dNTPs (dUTP, dATP, dGTP e dCTP) e polimerase. Os fragmentos de cDNA são reparados na extremidade e ligados a adaptadores específicos da plataforma.

A principal diferença entre sequenciação de lncRNA e convencional sequenciação do transcriptoma A construção da biblioteca reside no método de enriquecimento do RNA alvo. O primeiro utiliza um processo de seleção negativa para remover o rRNA, enquanto o segundo utiliza seleção positiva para enriquecer principalmente. mRNA com passos subsequentes idênticos. Após a qualificação da amostra, inicia-se a construção da biblioteca. O RNA total (>200) é extraído de amostras de tecido e o rRNA é removido da amostra utilizando um kit de reagentes. Após a fragmentação, primers aleatórios e transcriptase reversa são utilizados para sintetizar a primeira cadeia de cDNA, seguida pela síntese da segunda cadeia de cDNA. O cDNA de dupla cadeia purificado passa por reparação das extremidades, adição de adenilato e ligação de adaptadores de sequenciamento. Finalmente, as bibliotecas de cDNA são obtidas através da amplificação por PCR.

Figura 2. Ilustração da construção da biblioteca de lncRNA-seq.

Deteção e sequenciação de bibliotecasApós a construção da biblioteca, são realizadas a quantificação inicial e a diluição, e depois é testado o tamanho dos fragmentos da biblioteca. Para determinar a qualidade da biblioteca, podemos olhar principalmente para o estado de degradação do mRNA e o tamanho dos fragmentos inseridos. Se ocorrer degradação do mRNA, as sequências que se degradaram mostrarão poucas, ou mesmo nenhuma, alinhamentos de leitura. Quanto maior a aleatoriedade do mRNA fragmentação, quanto mais uniforme for a cobertura das leituras dentro de cada área. O sequenciamento Hiseq/Miseq é realizado após a inspeção da biblioteca.

Análise de Dados de Sequenciação de LncRNA

O processo de análise para sequenciação de lncRNA, em comparação com o sequenciamento do transcriptoma, representa uma distinção significativa — a necessidade de discriminar entre mRNA e lncRNA. A diferença fundamental entre mRNA e lncRNA é a natureza não codificante do lncRNA. Com base no seu potencial de codificação, pode-se fazer uma diferenciação entre mRNA e lncRNA. Até agora, mesmo para espécies modelo, as entradas de lncRNA nos genomas de referência não são exaustivamente abrangentes. Assim, durante a análise, há frequentemente a necessidade de montar ou prever novos transcritos (aqueles não incluídos no genoma de referência). Subsequentemente, esses novos transcritos montados precisam ser avaliados quanto ao seu potencial de codificação para obter os dados de sequência e expressão dos lncRNAs recém-preditos. sequenciação de lncRNA pode analisar a expressão e a informação diferencial do mRNA, a expressão e a informação diferencial de lncRNAs conhecidos (incluídos no genoma de referência) e lncRNAs recém-preditos, bem como possíveis relações regulatórias entre lncRNAs e mRNAs. As análises que podem ser realizadas de forma ordinária sequenciação do transcriptoma pode também ser implementado em sequenciação de lncRNA.

A análise de dados e a identificação de lncRNAs estão listadas da seguinte forma:

Figura 3. Visão geral da análise de dados e identificação de lncRNAs.

(1) Pré-processamento de dados

• Avaliação da qualidade. Após a obtenção dos dados brutos (ficheiros fastq), a qualidade das leituras originais, incluindo a distribuição da taxa de erro de sequenciação e a distribuição do conteúdo de GC, é avaliada utilizando o FastQC v0.11.3.
• Filtragem de dados. As sequências originais de sequenciamento contêm leituras de baixa qualidade e sequências de adaptadores. Para garantir a qualidade da análise de dados, as leituras brutas devem ser filtradas para obter leituras limpas, e a análise subsequente baseia-se em leituras limpas. A filtragem de dados inclui principalmente a remoção de sequências de adaptadores nas leituras, a remoção de leituras com alta proporção de N (N denota a informação de base não determinada) e a remoção de leituras de baixa qualidade. Este processo é realizado utilizando o Cutadapt e o Trimmomatic.

(2) Avaliação geral da qualidade do RNA-seq. Inclui principalmente a avaliação da correlação entre amostras (coeficiente de correlação de Pearson) e a avaliação da distribuição uniforme.

(3) Alinhamento das leituras ao Genoma de Referência. O alinhador STAR e o Tophat 2 são frequentemente utilizados para o alinhamento de leituras. Se o genoma de referência for corretamente selecionado e não houver contaminação nos experimentos, os resultados do mapeamento (total de leituras ou fragmentos mapeados) normalmente seriam superiores a 70%.

(4) Exploração de dados. Após os ficheiros serem organizados, utiliza-se o DESeq2 para a exploração de dados. Os resultados obtidos podem ser utilizados para análise de agrupamento e análise de PCA (análises de componentes principais) entre amostras de RNA-seq, e a relação entre as amostras pode ser explorada ou o desenho experimental pode ser verificado. Quanto mais próxima for a distância de agrupamento das amostras ou a distância de PCA, mais semelhantes são as amostras.

(5) Montagem de transcrições. As transcrições são montadas com o software Cufflinks ou Scripture. O Cufflinks utiliza um modelo de probabilidade para montar e quantificar o nível de expressão do conjunto de isoformas o mais pequeno possível ao mesmo tempo, para fornecer a explicação de máxima verossimilhança dos dados de expressão no ponto de mapeamento, e para fornecer a informação da cadeia com precisão, utilizando parâmetros específicos para a biblioteca específica da cadeia. O Scripture, que se baseia num modelo de segmentação estatística para distinguir entre os locais de expressão e o ruído de fundo experimental, fornece informações sobre todas as isoformas com expressão estatisticamente significativa no local de mapeamento, e é aplicável à montagem de transcrições longas.

Triagem de lncRNA candidatos

• Triagem básica. O rastreio básico consiste em três etapas: os transcritos, cuja extensão é superior a 200 bp e o número de exões é superior a 2, são selecionados em primeiro lugar; em seguida, a cobertura de cada transcrito é calculada pelo Cufflinks, e os transcritos com uma cobertura mínima de leituras superior a 3 são selecionados; por fim, os não-lncRNAs são filtrados por comparação com não conhecidos.lncRNAe os resultados do Cuffmerge são utilizados para a triagem de posições (um código de classe diferente é selecionado para diferentes tipos de lncRNA).
• Avaliação do Potencial de Programação. O potencial de codificação é o fator chave para julgar. lncRNA. Atualmente, os métodos principais de análise do potencial de codificação incluem a análise do Calculador de Potencial de Codificação (CPC), a análise do Índice de Codificação-Não Codificação (CNCI), a análise de domínios proteicos PFAM e a análise PhyloCSF.

Análise de expressão. Inclui principalmente comparação de níveis de expressão, análise de expressão diferencial e triagem de lncRNA de expressão diferencial, análise de clusters de expressão de lncRNA e análise específica de tecido ou fenótipo. Estas análises são geralmente realizadas utilizando DESeq ou Cuffdiff.

(8) Análise avançada

• LncRNA previsão de genes-alvo. A função da lncRNA está relacionada com o gene da proteína codificadora adjacente. Os genes de proteínas codificadoras adjacentes à lncRNA são identificados para análise de enriquecimento funcional, e a principal função da lncRNA pode ser prevista no lncRNATargets.
• Análise de enriquecimento funcional de lncRNA específicos. O lncRNA específico refere-se geralmente ao lncRNA com expressão diferencial ou expressão específica de tecido ou fenótipo. A análise de enriquecimento funcional desses lncRNAs específicos pode ser realizada, respetivamente, através do GO e do KEEG.
• Análise de interação. LncRNA e mRNA pode ser relacionado através da relação de direcionamento, e o mRNA pode ser relacionado pela proteína, formando assim a rede de interação lncRNA-mRNA-proteína. Esta interação pode ser visualizada pelo Cytoscape.

Usando o estudo de Wei et al. intitulado "A análise de sequenciação de RNA não codificante de cadeia longa revela os perfis moleculares de células epiteliais mamárias induzidas quimicamente", iremos explicitar a análise de dados de Sequenciação de LncRNA.

Identificação de transcritos de lncRNA:

Análise do potencial de codificação utilizando várias ferramentas de software, como CNCI, CPC, Pfam-scan e CPAT. Os transcritos não codificantes identificados por estas ferramentas foram contados, e os transcritos comuns e únicos de cada método foram visualizados utilizando diagramas de Venn. A interseção dos resultados previstos foi considerada para análise subsequente como o conjunto de dados para novos lncRNA.

Figura 4. Identificação de transcritos de lncRNA.

Estrutura e caracterização de lncRNAs:

Através análise bioinformática, pode-se comparar aspectos de lncARNs e os RNAs mensageiros (mRNAs) como o comprimento dos seus transcritos, o número de exões e os respetivos níveis de expressão. Os resultados podem revelar a área concentrada dos comprimentos de lncRNA, a quantidade de exões em lncRNAs, bem como fornecer uma medida comparativa dos volumes de expressão global entre mRNAs e lncRNAs.

Figura 5. Análise comparativa das características estruturais do lncRNA e do mRNA.

Análise de expressão diferencial de lncRNAs:

O DESeq foi utilizado para a análise de expressão diferencial, utilizando critérios de |log2Fold Change|≥2 e p < 0,05. Os lncRNAs identificados como expressos diferencialmente de forma significativa incluíram tanto transcritos conhecidos como novos. Foram geradas heatmaps para visualizar os padrões de expressão dos genes expressos diferencialmente. lncARNs entre grupos.

Figura 6. Análise de lncRNA diferencialmente expressos.

Predição de mRNA alvo de lncRNA diferencialmente expresso:

Predição de genes-alvo de DE lncARNs utilizando métodos de análise de alvos cis e trans. Identificação de genes-alvo comuns entre múltiplos significativamente diferentes. lncARNsVisualização em mapa de calor dos genes-alvo expressos de forma diferente entre grupos experimentais.

Figura 7. Mapa de calor dos genes alvo diferencialmente expressos.

Validação da expressão de lncRNAs e genes-alvo por RT-PCR:

Seis lncRNAs DE e quatro genes-alvo candidatos foram selecionados para validação utilizando RT-qPCR. Os níveis de expressão dos selecionados lncARNs e os genes-alvo foram medidos em fibroblastos de cabra e em células epiteliais mamárias induzidas. Os resultados de RT-qPCR foram consistentes com as tendências de expressão observadas nos dados de sequenciação do transcriptoma, confirmando a precisão dos resultados de sequenciação.

Figura 8. Comparação dos resultados da análise de lncRNA-seq e RT-qPCR de lncRNAs DE e genes-alvo no grupo CK vs. grupo 5i8d.

Análise de Anotação Funcional de Genes Alvo: GO e KEGG:

Os resultados da Ontologia Genética (GO) estão divididos em três categorias: Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF). Através da implementação de análises de enriquecimento de GO, foi revelado que estes genes-alvo desempenham papéis dinâmicos na regulação de uma infinidade de processos biológicos, incluindo a modulação de processos metabólicos, síntese de proteínas, ligação a recetores e a regulação da atividade da tirosina quinase. A análise de enriquecimento proveniente da Enciclopédia de Genes e Genomas de Quioto (KEGG) forneceu insights adicionais, ajudando a compreender as vias biológicas e as redes de transdução de sinais nas quais estes genes-alvo estão implicados.

Figura 9. Análise de anotação funcional dos genes-alvo.

Rede de Interacção de lncRNA e mRNA:

Além disso, com base na expressão diferencial reconhecida de genes de lncRNA e mRNA, juntamente com os genes-alvo cis e trans previstos de lncRNApoderia construir uma análise de rede regulatória para representar a intrincada interação entre lncRNAs diferencialmente expressos e os seus respetivos genes-alvo.

Figura 10. A rede regulatória de lncRNAs expressos diferencialmente e genes-alvo.

A Vantagem da Sequenciação de LncRNA

Otimização de Biblioteca: Empregando métodos de depleção de RNA ribossómico e construção de bibliotecas específicas de fitas, a nossa abordagem preserva a integridade de ambos. lncRNA e sequências de mRNA, bem como a sua informação direcional.

Sequenciação Abrangente: Quase todas as sequências de lncRNA e mRNA nas amostras foram identificadas e analisadas, garantindo uma cobertura abrangente.

Alta Sensibilidade e Resolução: Aproveitando a tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, o sequenciamento de LncRNA permite a deteção e quantificação de expressões baixas. LncARNs com notável sensibilidade e resolução.

Diversidade de Espécies: Realizámos a identificação e análise de lncRNAs numa ampla gama de espécies, abrangendo humanos, animais e plantas, sublinhando a diversidade do âmbito taxonómico da nossa investigação.

Dinamicidade: Sequenciação de LncRNA serve como uma ferramenta poderosa para estudar os padrões de expressão dinâmica de lncRNAs, abrangendo mudanças em diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estados fisiológicos. Isto elucida os mecanismos regulatórios espaciotemporais de lncARNs em vários processos biológicos.

Análise Rigorosa: A nossa abordagem envolveu a curadoria meticulosa de bases de dados de lncRNA para a identificação de lncRNAs conhecidos e a implementação de critérios de filtragem rigorosos para descobrir novos lncRNAs, garantindo a precisão e a fiabilidade da nossa análise.

Correlações Abrangentes: Inicie uma operação minuciosa associando lncRNA com mRNA, aprofundando-se nas redes regulatórias governadas por lncRNA.

Variabilidade Individual: sequenciação de lncRNA pode revelar diferenças na expressão de lncRNA entre indivíduos, ajudando a compreender as variações na expressão específica de lncRNA em cada indivíduo e o seu papel em doenças únicas de certos indivíduos.

Ponto de Partida para Pesquisa Funcional: As expressões discrepantes de lncRNA podem ser filtradas. sequenciação de lncRNAEsta informação serve como um ponto central para esforços de investigação, explorando ainda mais a sua função e mecânicas regulatórias dentro dos processos biológicos.

Aplicação do Sequenciamento de LncRNA

A aplicação de comprimento total sequenciação de lncRNA A tecnologia conectou tipos celulares com o seu destino, estado e funcionalidade. Isso acelerou os desenvolvimentos em áreas como biologia do desenvolvimento, oncologia, neurociência, imunoinfecção e toxicologia ambiental.

Explorando os mecanismos moleculares de lncARNs em desenvolvimento e crescimento. Por exemplo, Li et al. descobriram um novo lncRNA trans-atuante gerido pela marca epigenética de acetilação da lisina 4 da histona H3 do gene ACTG1. Estas descobertas constroem a base teórica para futuras análises funcionais a montante e a jusante de lincRNAs em Brassicaceae. Além disso, Yu et al. descobriram que sob alta intensidade de luz, o lncRNA de maçã MdLNC610 está envolvido na acumulação de antocianinas na pele da maçã através da ativação da biossíntese de etileno. Estas descobertas inovadoras demonstram os papéis fundamentais desempenhados pelos lncRNAs no crescimento e desenvolvimento das plantas.

A construção de atlas de lncRNA de comprimento completo em diferentes espécies/tecidos/doenças permite a determinação de lncRNA padrões de expressão dentro de linhagens filogenéticas. Por exemplo, Kyle Palos e colegas construíram uma base de dados de longas RNAs não codificantes intergénicas (lincRNAs) de quatro espécies de Brassicaceae, ao reunir várias bases de dados de lincRNA, bem como técnicas de RNA-seq de leitura curta e longa. Não só conseguiram confirmar as sequências conservadas de lincRNAs de comprimento total, como também estabeleceram os seus elementos funcionais, como sORFs, regiões estruturais e sequências de interação com miRNA, estabelecendo assim a base teórica para uma análise mais aprofundada das funcionalidades de lncRNA a montante e a jusante na família Brassicaceae.

Figura 11. Identificação e características básicas dos lincRNAs em quatro plantas crucíferas. (Palos et al., 2022)

No campo da oncologia, analisar o splicing anormal de genes em células tumorais e amostras do microambiente e investigar a chave. lncRNA os participantes e reguladores no processo de splicing podem ajudar a decifrar os mecanismos moleculares do lncRNA na progressão tumoral. Isso também pode auxiliar no desenvolvimento de marcadores moleculares de diagnóstico precoce de tumores. Por exemplo, Lan et al. descobriram que lncRNA O SNHG6 pode induzir a hnRNPA1 a splicar o mRNA PKM de forma específica, aumentando assim a relação PKM2/PKM1, melhorando a glicólise aeróbica nas células do câncer colorretal e, portanto, promovendo a carcinogénese.

Figura 12. A expressão das proteínas hnRNP está positivamente correlacionada com a expressão de SNHG6 no câncer colorretal. (Lan et al., 2020)

O estudo das respostas das células imunes do hospedeiro, revelando a regulação funcional de RNAs longos não codificantes (lncRNAs) envolvidos nas respostas imunes do hospedeiro, são de importância primordial. Descobertas recentes demonstram que o fator de transcrição FUBP3 pode atuar como uma proteína de ligação ao RNA, interagindo sinergicamente com a lncRNA EST12 para suprimir a expressão de citocinas como a Interleucina (IL)-1β e IL-6, promovendo assim a proliferação de Mycobacterium tuberculosis (MTB). Foi observado que a infecção com a estirpe padrão de MTB H37Rv leva à downregulação da expressão da lncRNA GAS5 em macrófagos, e ao direcionar o miR-18a-5p, há um consequente aumento da vitalidade dos macrófagos. Em paralelo, os níveis de expressão das lncRNAs NORAD e SNHG16 aumentam após a infecção. Esses lncARNs regulam negativamente os seus respetivos genes-alvo miR-618 e miR-140-5p, conseguindo controlar a proliferação de macrófagos e as respostas inflamatórias, influenciando assim o resultado da infeção por MTB.

A pesquisa investiga as alterações na expressão de RNAs longos não codificantes (lncRNAs) a nível celular sob o stress de vários tipos de poluentes ambientais. Estes poluentes incluem hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, bifenilos policlorados, éteres difenílicos polibromados, benzeno, compostos de bisfenol, substâncias per- e polifluoradas, produtos farmacêuticos e de cuidados pessoais, pesticidas, metais pesados, nanomateriais e partículas PM2.5. O objetivo é desvendar as questões na interseção da toxicologia ambiental e revelar os mecanismos moleculares pelos quais lncARNs contribui para os efeitos de toxicidade dos contaminantes ambientais. Cao et al. selecionaram vários lncRNAs bem estudados, incluindo Birc6-AS2, Mettl3, Malat1, Stedlb1a e Oip5-AS como alvos de referência. Eles expuseram embriões de zebrafish a soluções de cloreto de mercúrio, metilmercúrio, cloreto de chumbo, cloreto de cádmio e ácido crómico. Encontraram expressão diferencial do lncRNA Malat1 sob exposição a cloreto de mercúrio e metilmercúrio. Concurrentemente, o grupo de embriões de zebrafish expostos ao mercúrio apresentou distúrbios neurocomportamentais notáveis, indicando que a indução específica do mercúrio de lncRNA está envolvido nos efeitos neurotóxicos do mercúrio.

Se estiver interessado no nosso sequenciação de lncRNA serviço, sinta-se à vontade para contactar os nossos cientistas. Além disso, oferecemos um pacote de sequenciação de transcriptómica serviços envolvendo RNA-seq, sequenciação de pequenos RNAs, sequenciação de circRNA, sequenciação de degradoma, e sequenciação de RNA bacteriano.

Referências:

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