Visão Geral da Sequenciação por Imunoprecipitação de DNA Metilado (MeDIP-seq)

O que é MeDIP-Seq?

A metilação do DNA é uma epigenético marca que desempenha um papel crucial em muitos processos biológicos, como o desenvolvimento embrionário, a regulação genética e a génese de doenças. O 5-metilcitosina (5mC) é uma forma metilada comum da base de DNA citosina. A combinação de diferentes métodos de pré-tratamento seguidos por diferentes técnicas de biologia molecular subsequentes, como Microarranjos de ADN e sequenciação de nova geração (NGS), torna o mapeamento da metilação do DNA viável em todo o genoma. Várias tecnologias baseadas em NGS para detetar a metilação do DNA foram resumidas na Tabela 1 (Su, 2012).

Tabela 1. Tecnologias baseadas em NGS para detetar a metilação do DNA.

Imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP), que foi descrito pela primeira vez em 2005 (Weber et al., 2005), é uma técnica de purificação em escala genómica utilizada para enriquecer fragmentos de DNA metilado com anticorpos específicos. Sequenciação MeDIP (MeDIP-Seq) descrito pela primeira vez em 2008 é uma ferramenta poderosa utilizada para estudar 5mC e 5-hidroximetilcitosina (5hmC) modificação ao combinar MeDIP com sequenciação de alto rendimento (Down et al., 2008). O sequenciamento profundo poderia fornecer uma grande cobertura do genoma e revelar a maioria do DNA metilado imunoprecipitado.

Como Funciona o MeDIP-Seq

O fluxo de trabalho de MeDIP-seq está ilustrado na Figura 1. Começa com a isolação de fragmentos de DNA metilados por 5mC-anticorpos específicos através de imunoprecipitação. Em seguida, o DNA metilado enriquecido é submetido a purificação de DNA, preparação de biblioteca e sequenciação de alto rendimento (Taiwo et al., 2012).

Figura 1. Fluxo de trabalho do MeDIP-seq.

Quais são as Vantagens do MeDIP-seq

• Cobertura CpG e não CpG 5mC por todo o genoma.
• Esteja na escala do genoma completo ou em quaisquer regiões de interesse.
• Evite o enriquecimento não específico para 5hmC utilizando um anticorpo específico para 5mC durante o processo de MeDIP.
• Requer DNA de baixo input.

Quais são as limitações do MeDIP-seq?

• Resolução genómica: a resolução do metiloma é inferior (~150 pb) em comparação com a resolução de base única oferecida pela sequenciação com bisulfito.
• Interação não específica: a especificidade e seletividade do anticorpo devem ser testadas para evitar interações não específicas.
• Viés de seleção baseado em anticorpos: a recuperação de DNA metilado pelo anticorpo é afetada pela densidade de mC/mCG, fazendo com que regiões de densidade muito baixa (<1,5%) possam estar sub-representadas ou até mesmo interpretadas como não metiladas (Taiwo et al., 2012). A seleção baseada em anticorpos é tendenciosa em direção a regiões hipermetiladas.

Como é analisado o dado MeDIP-Seq

Um pipeline de bioinformática comumente utilizado para análise de MeDIP-seq os dados estão mostrados na Figura 2.

Figura 2. Pipeline de bioinformática para análise de dados MeDIP-seq.

Vários ferramentas computacionais foram desenvolvidas para a análise de dados de MeDIP, incluindo Batman, MEDIPS, MeDUSA e MeQA (Tabela 2). O método a ser utilizado depende em grande parte do objetivo do experimento.

Tabela 2. Exemplos de software disponível para a análise de dados de MeDIP-seq

Quais são as Diferenças Entre Medip-Chip e Medip-Seq

O DNA metilado purificado através de MeDIP pode ser introduzido em métodos de deteção de DNA de alto rendimento, como microarrays de DNA de alta resolução (MeDIP-chip) ou sequenciação de alto rendimento (MeDIP-SeqO resumo do fluxo de trabalho do MeDIP-chip e do MeDIP-Seq está ilustrado na Figura 3. No MeDIP-chip, uma fração do DNA de entrada e o DNA metilado enriquecido são marcados com cianina-5 (Cy5; vermelho) e cianina-3 (Cy3; verde), respetivamente, para identificar sequências que mostram diferenças significativas a níveis de hibridização, confirmando assim que a sequência de interesse está enriquecida.

Figura 3. Visão geral do fluxo de trabalho do procedimento MeDIP seguido por (A) hibridação em array ou (B) sequenciação de alto débito.

Diferentes abordagens de análise de metilação de DNA têm forças e fraquezas concorrentes. A identificação de sequências de MeDIP baseada em array é limitada ao design do array. Como resultado, a resolução é restrita às sondas no design do array, enquanto a identificação de sequências de MeDIP baseada em sequência é geralmente aplicável a qualquer espécie para a qual exista um genoma de referência. Um resumo das características e potenciais fontes de viés para várias técnicas é apresentado na Tabela 3 (Laird, 2010).

Tabela 3. Características e fontes de viés para várias técnicas

RRBS: Sequenciação de bisulfito com representação reduzida
WGBS: sequenciação de bisulfito de genoma completo

Quais são as aplicações do MeDIP-Seq?

As vantagens de ser rentável e a necessidade de DNA de baixo custo (Taiwo et al., 2012; Zhao et al., 2014) tornam MeDIP-seq adequado para estudos envolvendo uma baixa quantidade de amostras de DNA, como oócitos, embriões precoces (Zhang et al., 2017) e biópsias tumorais humanas (Kim et al., 2011; Zhao et al., 2014).

Analisando Padrões de Metilação do DNA: MeDIP-seq pode ser utilizado para analisar padrões de metilação do DNA dentro do genoma, abrangendo padrões globais e regiões específicas de genes. Ao observar o espectro de metilação em diferentes amostras, podem ser identificadas e quantificadas alterações na metilação, revelando os mecanismos regulatórios da metilação do DNA em diversos contextos biológicos.

Identificação de Genes Alvo de MetilaçãoO MeDIP-seq pode ser utilizado de forma eficaz para identificar genes de metilação associados a processos biológicos ou doenças específicas. Ao estudar a relação entre os níveis de metilação e a expressão gênica, é possível determinar potenciais genes-alvo regulados pela metilação. Isso, por sua vez, permite um exame aprofundado da sua funcionalidade e mecanismos de controlo em fenómenos biológicos.

Diagnóstico e Tratamento de Doenças: MeDIP-seq A tecnologia desempenha um papel crucial na investigação da contribuição da metilação do DNA para a génese e progressão de doenças, estabelecendo assim uma base para procedimentos de diagnóstico, planos de tratamento e medidas preventivas. A análise comparativa dos padrões de metilação em tecidos saudáveis e doentes pode facilitar a identificação de marcadores de metilação associados e fornecer uma visão sobre uma ampla gama de doenças. Isso pode ajudar a abrir caminho para abordagens terapêuticas inovadoras no âmbito da medicina personalizada.

Regulação da Metilação no Desenvolvimento e DiferenciaçãoO MeDIP-seq pode ser instrumental na exploração de alterações dinâmicas na metilação do DNA ao longo dos processos de desenvolvimento e diferenciação, iluminando assim a função da metilação na determinação do destino celular e na influência no desenvolvimento dos tecidos. Ao estudar de perto os padrões de metilação em várias fases do desenvolvimento ou dentro de tipos celulares específicos, é possível identificar eventos de metilação integrais e, assim, aprofundar a nossa compreensão dos mecanismos que orquestram o desenvolvimento e a diferenciação.

Interacção de Fatores Ambientais e Metilação: MeDIP-seq constitui uma ferramenta poderosa na investigação das repercussões das influências ambientais na metilação do ADN e na decifração da complexa relação entre o ambiente e a regulação epigenética. As comparações feitas a partir dos padrões de metilação de amostras sujeitas a diversos elementos ambientais permitem uma observação clara das modificações de metilação induzidas. Isso fornece insights críticos para futuras pesquisas sobre a sua relevância na adaptação ambiental e na variabilidade genética.

Na CD Genomics, estamos dedicados a fornecer soluções fiáveis. sequenciação epigenómica serviços, incluindo sequenciação de bisulfito direcionada, sequenciação de bisulfito com representação reduzida (RRBS), sequenciação de bisulfito de genoma completo, Sequenciação MeDIPe ChIP-seq.

Referências:

1. Down, T.A., Rakyan, V.K., Turner, D.J., Flicek, P., Li, H., Kulesha, E., Graf, S., Johnson, N., Herrero, J., Tomazou, E.M., et al. (2008). Uma estratégia de deconvolução Bayesiana para a análise do metiloma de DNA baseada em imunoprecipitação. Biotecnologia da Natureza 26, 779-785.
2. Kim, J.H., Dhanasekaran, S.M., Prensner, J.R., Cao, X., Robinson, D., Kalyana-Sundaram, S., Huang, C., Shankar, S., Jing, X., Iyer, M., et al. (2011). A sequenciação profunda revela padrões distintos de metilação do DNA no câncer da próstata. Pesquisa genómica 21, 1028-1041.
3. Laird, P.W. (2010). Princípios e desafios da análise de metilação de DNA em todo o genoma. Nature Reviews Genetics 11, 191-203.
4. Su, J. (2012). Avanços em Ferramentas de Bioinformática para Dados de Sequenciação de Alto Débito de Metilação de DNA. Genética Hereditária 01.
5. Taiwo, O., Wilson, G.A., Morris, T., Seisenberger, S., Reik, W., Pearce, D., Beck, S., e Butcher, L.M. (2012). Análise do metiloma utilizando MeDIP-seq com baixas concentrações de DNA. Protocolos da Natureza 7, 617-636.
6. Weber, M., Davies, J.J., Wittig, D., Oakeley, E.J., Haase, M., Lam, W.L., e Schubeler, D. (2005). Análises em toda a cromossoma e específicas de promotores identificam locais de metilação diferencial de DNA em células humanas normais e transformadas. Genética da Natureza 37, 853-862.
7. Zhang, Y., Gou, W., Ma, J., Zhang, H., Zhang, Y., e Zhang, H. (2017). Metilação do genoma e funções regulatórias para a adaptação hipóxica em embriões de frango tibetano. PeerJ 5, e3891.
8. Zhao, M.T., Whyte, J.J., Hopkins, G.M., Kirk, M.D., e Prather, R.S. (2014). Imunoprecipitação de DNA metilado e sequenciação de alto rendimento (MeDIP-seq) utilizando baixas quantidades de DNA genómico. Reprogramação celular 16, 175-184.