Diretrizes para Preparação de Amostras de Sequenciamento de Células Únicas

O padrão de células de alta qualidade para sequenciação

Número total de células: > 1×10⁵ células

Um número pequeno de células não é suficiente para um controlo de qualidade preciso, e um controlo de qualidade impreciso pode facilmente levar a problemas de qualidade dos dados de sequenciação.

Concentração celular: 700-1200 células/µl

Assegure-se de que um determinado volume de células de alta qualidade pode ser utilizado na máquina, e que a concentração de contagens repetidas não flutua mais do que ±100 células/µl.

Diâmetro celular ≤ 5 µm, diâmetro celular alvo <40 µm

Recomenda-se o uso de filtros celulares com tamanho de poro de 40 µm ou menos para filtrar detritos celulares e células aglomeradas, enquanto diâmetros celulares pequenos aumentam a taxa de multicelularidade e diâmetros celulares grandes tendem a ter poros bloqueados ou baixa eficiência de captura.

Viabilidade celular ≥85%

A viabilidade celular é um indicador de referência importante para refletir a integridade do RNA, pois células com danos severos ou dissociação excessiva não refletem bem a integridade do RNA, portanto, quanto maior a viabilidade celular, em princípio, melhor.

Condição de suspensão: usar PBS ou meio de cultura sem Ca²⁺, Mg²⁺, EDTA para resuspender completamente

Lavar duas vezes com DPBS e 0,04% BSA. A suspensão celular deve minimizar a aglomeração celular, detritos celulares excessivos, a presença de grandes detritos ou a presença de outras impurezas. Não devem estar presentes metal Ca²⁺, Mg²⁺, EDTA e outras substâncias que afetam a atividade da transcriptase reversa na resuspensão celular a bordo.

Diâmetro celular ≤ 5 µm, diâmetro celular alvo < 40 µm

Recomenda-se o uso de filtros celulares com tamanho de poro de 40 µm ou menos para filtrar detritos celulares e células aglomeradas. Diâmetros celulares pequenos aumentam a taxa de multicelularidade, enquanto diâmetros celulares grandes tendem a ter poros bloqueados ou baixa eficiência de captura.

Coleta de amostra de tecido

1. Tecido fresco: tamanho da amostra ≥ 0,2g
2. Tecido perfurado: não menos que 2 tiras (diâmetro ≥ 1,5 mm, comprimento 1,5 cm)
3. Tamanho de amostra muito pequeno: por favor contacte o suporte técnico, de acordo com a lesão da amostra, método de amostragem e condições de envio para dar conselhos razoáveis.
4. Notas sobre a coleta de amostras de tecido

• Amostragem consistente: O estado de coleta das amostras dos grupos experimental e de controlo deve ser o mais semelhante possível.
• Amostragem precisa: Remover tecidos não alvo, como gordura excessiva e envelope, e lavar para remover resíduos de sangue.
• Manter a amostra húmida: transferir a amostra para a solução de preservação de tecido o mais rápido possível após a amostragem. Amostras expostas ao ar por longos períodos são propensas à desidratação e morte das células na superfície do tecido. Para tecidos com diâmetros pequenos, a exposição prolongada pode resultar diretamente em amostras que não obtêm suspensão celular suficiente. Exemplos incluem amostras de punção, amostragem com pinças de biópsia de tecidos granulares de pequeno diâmetro.
• Evitar desfiguração: Evitar contaminação química e danos térmicos. Se o uso de faca a laser, faca elétrica e outras ferramentas de coleta de amostras for inevitável, a parte danificada termicamente deve ser removida; a amostragem por biópsia é melhor realizada em grandes pedaços cada vez que a amostra é presa para reduzir danos celulares e efeitos irreversíveis em experimentos subsequentes.

As amostras de tecido fresco devem estar completamente submersas em solução de preservação de tecido pré-resfriada a 2-8°C.

Preparação da amostra celular

1. PBMC células mononucleares do sangue periférico

• As células PBMC no sangue são geralmente isoladas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll.
• Se a sequenciação de células únicas não puder ser realizada imediatamente, após extrair PBMC em boas condições, pode-se optar por enviá-las após congelamento.

2. Cultivo de células

• Células com parede são geralmente dissociadas por digestão com enzima 0,25% Trypsina-EDTA; linhas celulares frágeis são tratadas com uma colagenase ligeiramente mais fraca para garantir efetivamente a viabilidade celular; células em suspensão podem ser misturadas diretamente por sopro suave da suspensão celular. Lave as células por resuspensão com PBS contendo 5% FBS ou 0,05% BSA (ou meio convencional).
• Colocar a 2-8°C e realizar a sequenciação de células únicas na máquina dentro de 2h. Para células que precisam ser transportadas ou preservadas, podem ser liofilizadas.

3. Congelamento celular

• A padronização do congelamento celular tem um grande impacto na qualidade do congelamento celular, e o procedimento de congelamento em gradiente deve ser rigorosamente observado.
• 1×10⁶-10⁷ células são resuspensas em 1mL de solução de liofilização celular, transferidas para tubos de liofilização espiral externa, programadas para resfriar até -80°C, e transferidas para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Células congeladas podem ser revividas para experimentos, consulte nossos especialistas técnicos para mais detalhes.

Preparação de amostra de organoides

Os organoides são geralmente cultivados em um gel de matriz composto por matriz extracelular, contendo algum laminina, colágeno, fatores de crescimento, etc., que podem ser dissolvidos em líquido a 4°C e podem ser re-solidificados a 37°C, fornecendo um microambiente importante e suporte tecidual para o crescimento celular no espaço.

Preparação especial de amostras

• Célula frágil: recomenda-se a nucleação direta para obter suspensões nucleadas únicas
  Para tecidos celulares frágeis, como células parenquimatosas do fígado ou adipócitos maduros, que são propensos a ruptura e têm células maiores, é difícil obter uma suspensão celular única com uma alta porcentagem de células alvo por digestão enzimática, e recomenda-se que o tecido seja nucleado diretamente para obter uma suspensão nucleada única.
• Alto teor de gordura: recomenda-se a nucleação
  Para tecidos com alto teor de gordura, a densidade lipídica é baixa, portanto, está em estado flutuante ou suspenso durante a dissociação e centrifugação, não é fácil afundar (exceto adipócitos imaturos), e adipócitos maduros são facilmente removidos após centrifugação e descarte do sobrenadante e coleta através de peneira, apenas alguns adipócitos imaturos podem afundar e enriquecer durante a centrifugação e ser capturados na máquina, mas a porcentagem é limitada.
• Heterótipos celulares: aspiração do núcleo é recomendada para obter suspensões nucleadas de células únicas
  Para tecidos com heterótipos celulares, como músculo, coração, cérebro e nervo, o diâmetro celular é muito grande para passar pelo chip microfluídico, o que facilmente causará bloqueio do pipeline do chip e falha na geração de microgotas, portanto, recomenda-se escolher a extração do núcleo para obter dados de sequenciação de núcleo de célula única.
• Fácil de degradar: evitar lavagem excessiva e não transportar longas distâncias
  Para amostras que se degradam facilmente, como pâncreas (fluido enzimático auto-secreto) e intestino de rato (o intestino contém enzimas digestivas alimentares), deve-se ter cuidado para evitar lavagem excessiva e tentar não transportá-las por longas distâncias, e digeri-las na máquina o mais rápido possível.
• Tecido altamente danificado ou doente: conter tecido circundante para proteção
  Deve-se considerar tanto as necessidades do sujeito quanto garantir que o tecido esteja em boas condições (por exemplo, tecidos alvo altamente danificados ou doentes, a amostragem muitas vezes requer mais volume de tecido, incluindo o tecido da área circundante para proteção.
• Amostras de animais não-modelo
  Além de espécies convencionais como humanos, macacos, ratos, camundongos e outros mamíferos, a sequenciação de células únicas também é amplamente utilizada em organismos de água doce, animais marinhos, répteis, anfíbios, espécies de aves, insetos, plantas, etc. (por exemplo, zebrafish, águas-vivas, cobras, rãs, aves e pássaros, moscas-das-frutas, parasitas, hidróides, Arabidopsis, culturas, plantas protegidas) Muitas espécies precisam ser amostradas, preservadas e transportadas de acordo com as características das espécies e seu ambiente. Condições de preservação e transporte de acordo com as características das espécies e seu ambiente.

Classificação celular

Classificação por fluxo

A classificação celular por fluxo utiliza fluoresceína para marcar diferentes moléculas e distingue células alvo de células não alvo ajustando a voltagem apropriada, compensação, etc. No campo da sequenciação de células únicas, a classificação por fluxo pode distinguir populações celulares específicas e permitir a otimização da qualidade das suspensões de células únicas, permitindo estudos mais direcionados e precisos.

1. Recomenda-se a pré-experimentação antes da classificação para entender a porcentagem de conteúdo das células alvo como forma de otimizar as condições de classificação do citómetro de fluxo.
2. Tempo de classificação: dependendo da tolerância das células a serem classificadas, para garantir a viabilidade celular, recomenda-se terminar dentro de uma hora.
3. Solução de coleta de células: 1 x DPBS (ou meio), 0,04% BSA / 5% FBS.
4. Para células classificadas por fluxo, deve-se seguir o princípio de não essencial não congelante.

Classificação por esferas magnéticas imunológicas

A classificação celular por esferas magnéticas imunológicas é realizada anexando anticorpos específicos capazes de se ligar a antígenos de superfície celular a esferas magnéticas. De acordo com a diferença das células marcadas, a classificação por esferas magnéticas geralmente é dividida em duas categorias: classificação positiva e classificação negativa.

1. Para a classificação por esferas magnéticas, a distinção e seleção de kits de classificação positiva e negativa são particularmente importantes, e deve-se prestar atenção à confiabilidade dos reagentes de classificação e à eficiência de classificação.
2. Pré-experimentos para estimar a proporção de células alvo para facilitar a preparação formal da amostra.
3. A classificação de células raras pode ser selecionada usando o método de classificação composta, que é principalmente usado para classificação de subpopulações celulares ou separação de células de alta pureza.
4. Após a classificação, as células são facilmente aglomeradas, portanto, evite o enriquecimento por centrifugação em alta velocidade.

Considerações sobre a classificação

1. Lise de eritrócitos: se houver precipitação vermelha visível a olho nu na amostra original, as células vermelhas devem ser clivadas primeiro, mas deve-se prestar atenção ao tempo de clivagem para evitar danos a outras células.
2. Correção de contagem: o valor de contagem celular da classificação por fluxo pode ser maior do que o total real de células (20-80%), exigindo contadores ou microscopia para correção de contagem.
3. Coleta de células: recomenda-se que a velocidade da centrífuga esteja dentro de 500 g, mais de 500 g levará facilmente à resuspensão ou aglomeração celular. Se estiver preocupado com a coleta de células, pode aumentar o tempo de centrifugação.