Sequenciação e Montagem Revelam a Diversidade dos Padrões Evolutivos dos Cromossomas Sexuais

Introdução ao Sequenciamento e Montagem de Cromossomas Sexuais

Os cromossomos sexuais têm sido um ponto de pesquisa fascinante na biologia evolutiva e do desenvolvimento devido às suas trajetórias evolutivas específicas e diversas, incluindo os cromossomos sexuais X/Y, Z/W e U/V. No entanto, os cromossomos sexuais têm sido as regiões mais difíceis e menos eficazes para a montagem e anotação do genoma de plantas e animais. Com as rápidas melhorias nas tecnologias de sequenciação, montagem e escoramento do genoma, agora é viável construir montagens de tipagem de cromossomos sexuais.

Os cromossomos sexuais, que compreendem os cromossomos X e Y, são determinantes fundamentais do sexo biológico, cada um desempenhando papéis distintos em várias espécies. O sequenciamento e a montagem dos cromossomos sexuais representam um esforço complexo, mas indispensável, envolvendo múltiplos passos processuais. Inicialmente, a coleta de amostras e a extração de DNA são imperativas, seguidas pelo sequenciamento do DNA extraído utilizando plataformas de sequenciamento modernas, como a Illumina. PacBio SMRTe Oxford NanoporeEstas tecnologias de sequenciação produzem extensos fragmentos de sequência de DNA, estabelecendo as bases para análises subsequentes. Após a sequenciação, é realizado um processamento e purificação meticulosos dos dados de sequência gerados para eliminar sequências de baixa qualidade e contaminação. Subsequentemente, é utilizada uma combinação de sequenciação de extremidade pareada ou sequenciação de leitura longa os dados são utilizados para melhorar a precisão e a qualidade do sequenciamento. Através destes esforços de sequenciamento, a identificação e segregação das sequências dos cromossomos X e Y são alcançadas, servindo como base para a montagem dos cromossomos sexuais e uma análise abrangente adicional.

Quais são as Estratégias para a Montagem dos Cromossomas Sexuais

A análise dos cromossomos sexuais em diferentes espécies é um aspecto crucial da investigação genómica destinada a compreender os mecanismos de determinação do sexo e a diversidade genética. Existem várias estratégias utilizadas neste processo, cada uma com as suas vantagens e desafios únicos.

A primeira abordagem envolve sequenciar individualmente os cromossomos sexuais da espécie através de técnicas de enriquecimento direcionado, como o método do transportador micro-nuclear ou sequenciação de células únicas. Este método isola os cromossomos sexuais dos outros cromossomos e realiza sequenciação separada, aumentando assim a cobertura e a profundidade dos cromossomos sexuais. Consequentemente, isso leva a uma montagem mais abrangente e precisa dos cromossomos sexuais.

A segunda estratégia envolve especificar os cromossomos sexuais aumentando a profundidade de sequenciação em todo o sequenciação do genoma projeto. Esta ampliação garante a cobertura de todas as regiões dos cromossomos sexuais. Ao aumentar a profundidade de sequenciação, a cobertura e a fiabilidade dos cromossomos sexuais são melhoradas, facilitando assim uma melhor montagem e análise.

A abordagem final combina de novo sequenciação com métodos de reordenamento. Inicialmente, de novo sequenciação é utilizado para obter resultados preliminares de montagem dos cromossomos sexuais. Subsequentemente, tecnologias de re-sequenciação, como sequenciação de leitura longasão utilizados para preencher lacunas na sequência e resolver regiões repetitivas complexas na montagem. Esta estratégia integrada melhora a continuidade e a precisão da montagem dos cromossomos sexuais, particularmente na abordagem de sequências repetitivas complexas.

Montagem do Cromossoma Y em Gorilas e Humanos

As sequências do cromossoma Y dos mamíferos são críticas para o estudo da determinação do sexo, mas o cromossoma Y é rico em sequências repetitivas e palindrómicas, sendo a parte mais difícil do genoma de se montar. Os investigadores obtiveram o genoma do cromossoma Y do gorila através da Illumina e Sequenciação PacBiocom um tamanho de 25,4 Mb, com um N50 de andaimes de 97,45 Kb e um NG50 de 99,19 Kb.

Figura 1. O fluxo de trabalho aplicado para a montagem do cromossoma Y do gorila (Tomaszkiewicz M et al., 2016)

Semelhante ao cromossoma sexual do gorila, o cromossoma Y humano possui uma sequência altamente legível e é extremamente difícil de montar. O DNA do cromossoma Y obtido através de separação por fluxo e enriquecimento foi sequenciado por uma combinação de leituras curtas e sequenciação de leitura longaApós a montagem, a versão inicial da montagem foi aprimorada com software pilon usando NGS dados com maior precisão de base única, seguidos por uma ronda adicional de correção de erros com Racon, resultando num tamanho do genoma do cromossoma Y de 21,5 Mb. Comparado com a montagem do cromossoma Y do gorila (contig N50=17,95Kb), a continuidade foi melhorada em 80 vezes (contig N50=1,46Mb).

Figura 2. Montagem do cromossoma-Y humano (Kuderna L F K et al., 2019)

Para genomas altamente repetitivos como os dos mamíferos, o uso de sequenciação de leitura longa pode simplificar significativamente a montagem dos cromossomos sexuais e poderia teoricamente ser estendido a outras espécies.

Montagem e Evolução dos Cromossomas Sexuais em Aves

Neste estudo, os genomas de cinco fêmeas de aves do paraíso foram sequenciados pela Illumina e montados usando o ALLPATHS-LG. Usando as sequências publicadas do cromossoma Z dos genomas do chapim-real e da corvo-de-capuz como genomas de referência, as espécies sequenciadas foram comparadas em todo o genoma com os genomas de referência, e o scaffold na comparação foi classificado como uma sequência do cromossoma Z, e os cromossomas Z foram montados. Teoricamente, os cromossomas Z e W das fêmeas das aves do paraíso deveriam ser sequenciados a metade da profundidade dos autossomas, e o scaffold do cromossoma W deveria ser selecionado para completar a montagem do cromossoma W com base no princípio.

No presente estudo, os cromossomos sexuais Z e W das aves foram montados através de uma comparação genómica com espécies que completaram o sequenciamento dos cromossomos Z, com base no princípio da redução da profundidade, que ajuda a explicar a evolução dos cromossomos sexuais das aves.

Evolução dos Cromossomas Sexuais no Espargo

No entanto, os genes responsáveis pela diferenciação sexual e os seus padrões de organização ainda estão pouco estudados, e os mecanismos de determinação do sexo e a composição dos cromossomos sexuais ainda são pouco claros. Neste estudo, os autores sequenciaram um indivíduo diploide (YY) de espargo-jardim macho através de Illumina e PacBio, montaram as leituras de Illumina usando SOAPdenovo2, preencheram lacunas com Gapcloser e construíram andaimes com SSPACE; usaram as leituras de PacBio com PBjelly2 para preencher lacunas e melhorar os andaimes com PBjelly2; realizaram o resequenciamento de 35 fêmeas XX e 39 supermachos YY, construindo um mapa de ligaçãoe montagem assistida por genoma utilizando mapeamento genético e óptico, resultando em um tamanho de genoma de 1,3G.

Neste estudo, o genoma diploide (YY) do Aspargo foi montado e as regiões determinantes do sexo foram identificadas. A análise de resequenciamento mostrou que as plantas dióicas surgiram apenas recentemente no género Aspargo e possuem a mesma morfologia XY; o estudo da estrutura gênica do cromossomo Y e do mecanismo de determinação do sexo das plantas dióicas fornece uma referência para a determinação do sexo no Aspargo.

Resumo

Sequenciação de leitura longa espera-se alcançar a montagem completa da sequência dos cromossomos sexuais o mais rapidamente possível. Até à data, centenas de cromossomos sexuais de plantas e animais foram sequenciados, montados e divulgados com diferentes graus de continuidade e completude. Como sequenciação do genoma as tecnologias continuam a avançar, alta fidelidade sequenciação de leitura longa continua a melhorar, e os algoritmos de montagem e andaimes fractais melhoram, espera-se que a montagem de pares de cromossomas sexuais altamente contíguos se torne em breve algo comum.

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Referências:

1. Tomaszkiewicz M, Rangavittal S, Cechova M, et al. Uma estratégia eficaz em termos de tempo e custo para sequenciar os cromossomas Y de mamíferos: uma aplicação à montagem de novo do cromossoma Y do gorila. Pesquisa Genómica, 2016, 26(4): 530-540.
2. Kuderna L F K, Lizano E, Julià E, et al. Sequenciação e montagem seletiva de moléculas únicas de um cromossoma Y humano de origem africana. Comunicações da Natureza, 2019, 10(1): 4.
3. Xu L, Auer G, Peona V, et al. História evolutiva dinâmica e conteúdo génico dos cromossomas sexuais em diversas aves canoras. Ecologia e Evolução da Natureza, 2019, 3(5): 834.
4. Harkess A, Zhou J, Xu C, et al. O genoma do espargo lança luz sobre a origem e evolução de um jovem cromossoma Y. Comunicações da Natureza, 2017, 8(1): 1279.