Isolamento de RNA Viral para Protocolo de Sequenciação de Próxima Geração

Purificação Parcial de Vírus de RNA

Coloque 25 ml de fluido alantoico infectado com IBV num tubo Falcon de 50 ml e centrifugue durante 10 minutos a 1.150 × g, a 4 °C, numa centrífuga de bancada.
2. Retire o sobrenadante e coloque por cima 10 ml de sacarose a 30 % num tubo de ultracentrifugação. Equilibre os tubos cuidadosamente.
3. Centrifugar durante 4 h, 102.400 × g, 4 °C numa ultracentrífuga.
4. Remova o sobrenadante em camadas, tendo cuidado para não perturbar o pellet.
5. Limpe os lados do tubo com um lenço de papel e prossiga diretamente para a próxima etapa, extração de RNA.

Extração de RNA

1. Adicione 1 ml de reagente TRIzol diretamente ao pellet do vírus, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo para misturar.
2. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
3. Adicione 200 μl de cloroformo e misture agitando durante 15 s.
4. Incubar durante 3 minutos à temperatura ambiente.
5. Centrifugar numa centrífuga de bancada durante 15 min, a 4 °C, 12.075 × g.
6. Com cuidado, retire a camada superior aquosa, que deve ser clara, e coloque-a num tubo limpo de 1,5 ml.
7. Adicione 0,5 ml de isopropanol e incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.
8. Centrifugar durante 10 min a 2.100 × g, a 4 °C, numa centrífuga de bancada.
9. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.
Adicione 0,75 m de etanol a 75 % ao pellet e misture por pipetagem.
11. Centrifugar durante 10 min, 12.075 × g, 4 °C numa centrífuga de bancada.
12. Remova o sobrenadante, com muito cuidado, e limpe as laterais do tubo com um lenço.
Deixe o pellet secar ao ar durante 5–10 minutos.
14. Ressuspenda o pellet em 25 μl de água estéril livre de RNAase e armazene a −20 ou −80 °C.