Sequenciação de RNA com Ultra Baixa Entrada: Aplicações, Plataformas e Vantagens

Sequenciação de RNA é um método válido para estudar o transcriptomao conjunto de todas as moléculas de RNA transcritas durante um período de desenvolvimento específico ou estado funcional em uma célula ou em uma população de células. O transcriptoma de um órgão ou tecido selecionado em um organismo sob uma condição específica pode ser obtido de forma rápida e completa através da sequenciação de RNA de próxima geração de alto rendimento, que abrange a quantificação da expressão génica, análise da expressão génica diferencial, deteção de variantes, caracterização de padrões de splicing alternativo, e perfilagem de RNA pequenoA RNA-seq pode ajudar a compreender a biologia complexa da expressão e regulação genética, explorando as características únicas de células individuais nos tecidos e entendendo a resposta de subpopulações celulares a sinais ambientais. A RNA-Seq também tem um grande potencial na investigação médica, como o perfilamento de biomarcadores, a inferência de vias passíveis de serem alvo de fármacos e os diagnósticos genéticos.

No entanto, os rigorosos requisitos de amostra e a aquisição de grandes quantidades de RNA de alta qualidade podem, por vezes, ser exigentes, tornando difícil situações como o sequenciamento a nível de células individuais ou onde apenas RNA escasso ou degradado pode ser obtido. Felizmente, a amplificação de amostras de RNA ultra-baixas pode resolver este problema. Os recentes avanços nas tecnologias de sequenciamento, potenciados pelo sequenciamento de nova geração (como as plataformas de sequenciamento Illumina), facilitaram as aplicações de RNA-Seq em múltiplos campos, propondo soluções para permitir o RNA-seq de amostras de baixa qualidade e/ou baixa quantidade. Os protocolos, que podem ser realizados através da utilização de uma estratégia de sequenciamento de comprimento total ou da realização de sequenciamento de RNA de expressão diferencial 3' utilizando seleção de poli-A ou depleção de rRNA, estão disponíveis para o perfilamento de vários tipos de RNA, incluindo, mas não se limitando a, mRNA, lncRNA e smRNA.

A RNA-Seq de entrada ultra-baixa forneceu uma poderosa abordagem alternativa para estudos transcriptómicos e facilita novas descobertas em relação à composição tecidual, dinâmicas de transcrição e relações regulatórias entre genes. Os rápidos desenvolvimentos tecnológicos ao nível da captura celular, fenotipagem, biologia molecular e bioinformática apontam para um futuro empolgante com numerosas aplicações biológicas e médicas.

Os vírus de RNA, como o coronavírus, HIV, HAV e vírus da gripe, representam sérias ameaças à saúde humana. O desenvolvimento de tecnologias de sequenciação de vírus de RNA precisas e sensíveis beneficiaria certamente a gestão da saúde pública e promoveria a investigação de métodos antivirais. A amplificação combinada de quantidades ultra-baixas de RNA viral com sequenciação Illumina, o RNA-Seq de entrada ultra-baixa, é capaz de gerar genomas virais completos ou quase completos a partir de clones e amostras clínicas com baixas quantidades de RNA viral e pode ser estendida a um grande número de amostras, excluindo a interferência da contaminação do hospedeiro.

Recomenda-se que a quantidade de RNA seja superior a 2 µg e que a concentração seja superior a 50 ng/µl para RNA-Seq regular fornecido pela maioria das plataformas comerciais, enquanto o RNA-Seq de ultra-baixo input pode reduzir significativamente os requisitos de amostra para nanogramas ou até mesmo para picogramas. Se as suas amostras forem células de tecido, centenas ou dezenas de células são suficientes para RNA-Seq de ultra-baixo input, e poucas ou até mesmo células únicas podem ser aceitáveis, o que proporciona a oportunidade de estudar diferenças entre células ou tipos celulares com uma resolução sem precedentes.