Protocolo de Preparação de Amostras para RIP-Seq

Obter Lisado Celular

1. Lave as células na placa de cultura ou frasco de cultura duas vezes com PBS frio.
2. Adicione PBS frio e raspe as células com um raspador de células, coletando-as em tubos Eppendorf.
3. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 min a 4°C, descartar o sobrenadante e recolher as células.
4. Ressuspenda as células com o mesmo volume de lisado RIP que as células, agite bem e deixe em gelo durante 5 minutos.
Dispense 200 μl de lisado celular em cada tubo e armazene a -80°C.

Preparação de esferas magnéticas e anticorpos

1. Ressuspensão de esferas magnéticas.
2. Rotule os tubos Eppendorf necessários para o experimento.
3. Pipete 50 μl das esferas ressuspendidas em cada tubo Eppendorf.
4. Adicione 500 μl de Tampão de Lavagem RIP a cada tubo e agite em vortex.
5. Coloque os tubos Eppendorf num suporte magnético, remova o sobrenadante, repita uma vez.
6. Resuspenda as esferas com 100 μl de Tampão de Lavagem RIP.
7. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
8. Coloque o tubo Eppendorf num suporte magnético e descarte o sobrenadante.
9. Adicione 500 μl de Tampão de Lavagem RIP, agite com vortex e sacuda, em seguida, descarte o sobrenadante e repita uma vez.
10. Adicione 500 μl de Tampão de Lavagem RIP, vortexe e agite, depois coloque no gelo.

Imunoprecipitação de Proteínas Ligadoras de RNA

1. Prepare o Tampão de Imunoprecipitação RIP.
2. Coloque os tubos Eppendorf do passo anterior num suporte magnético, remova o sobrenadante e adicione 900 µl de Tampão de Imunoprecipitação RIP a cada tubo.
3. Descongele rapidamente o lisado celular preparado no primeiro passo e centrifugue. Aspire 100 μl do sobrenadante no complexo de anticorpo com esferas magnéticas do passo anterior para fazer um volume total de 1 ml.
4. Incubar durante 3 h a 4°C até ao dia seguinte.
5. Centrifugue brevemente, coloque o tubo Eppendorf num suporte magnético e descarte o sobrenadante.
6. Adicione 500 μl de Tampão de Lavagem RIP, vortexe e agite o tubo Eppendorf no suporte magnético, descarte o sobrenadante e repita a lavagem 6 vezes.

Purificação de RNA

1. Prepare o Tampão de Proteinase K. 150 µl para cada amostra.
2. Ressuspenda o complexo de beads magnéticos-anticorpo acima com 150 µl de Tampão de Proteinase K.
3. Incubar a 55°C durante 30 minutos.
4. Após a incubação, coloque o tubo enpendoff num suporte magnético e transfira o sobrenadante para um novo tubo enpendoff.
Adicione 250 μl de Tampão de Lavagem RIP a cada tubo de sobrenadante.
6. Adicione 400 μl de fenol:cloroformio:álcool isoamílico a cada tubo, agite em vortex e sacuda, e centrifugue a 14.000 rpm durante 10 min à temperatura ambiente.
7. Aspire cuidadosamente 350 μl da fase aquosa superior para um novo tubo enpendoff.
Adicione 400 μl de cloroformo a cada tubo, agite em vortex durante 15 s e centrifugue a 14.000 rpm durante 10 min à temperatura ambiente.
9. Aspire cuidadosamente 300 μl da camada aquosa superior para um novo tubo enpendoff.
Adicione 50 μl da Solução I, 15 μl da Solução II, 5 μl do Acelerador de Precipitação, 850 μl de etanol anidro (sem RNase) a cada tubo, misture e mantenha a -80°C durante 1h até overnight.
11. Centrifugar a 14.000 rpm, 4°C durante 30 min, remover cuidadosamente o sobrenadante.
12. Lave uma vez com etanol a 80%, centrifugue a 14.000 rpm durante 15 min a 4°C, remova cuidadosamente o sobrenadante e deixe secar ao ar.
Dissolva 10-20 μl de DEPC em água e armazene a -80℃.