RIP-Seq – Mapeamento do Local de Ligação do Complexo Proteína-RNA e Interpretação da Regulação Epigenética

As moléculas dentro da célula comunicam-se entre si para executar a função celular normal. Os biomoléculas podem formar complexos entre si para desempenhar um papel específico. O RNA e as proteínas são conhecidos por interagir, formando complexos chamados ribonucleoproteínas ou RNPs, que são importantes na modificação e regulação pós-transcricional, como clivagem de RNA, transporte, localização, edição de sequência e outro controle translacional. A análise dos locais de ligação dessas ribonucleoproteínas é útil para entender a regulação transcricional e epigenética que ocorre na célula. As informações obtidas a partir desses estudos podem ser usadas para determinar alvos de doenças e desenvolver a descoberta de novos e eficazes alvos terapêuticos.

A imunoprecipitação é utilizada para isolar antígenos proteicos por meio de precipitação, utilizando a especificidade de ligação entre antígenos proteicos particulares e seus anticorpos correspondentes. Os resultados podem então ser analisados em um microarray. Esta técnica também pode ser usada para precipitar proteínas que estão em contato com RNA (RIP-Chip). Outra técnica relacionada é a Sequenciação por Imunoprecipitação de RNA ou RIP-Seq. Em vez de analisar a proteína que se ligou ao RNA, o RNA é o alvo do RIP-Seq. O componente de RNA é sequenciado usando técnicas de sequenciação de alto rendimento. O RIP-Seq mapeia o local de ligação do complexo proteína-RNA e fornece a sequência de base única do RNA ligado à proteína.

O RIP-Seq é comumente utilizado no estudo dos controles epigenéticos e transcriptômicos das ribonucleoproteínas. Sabe-se que revela a interação das duas biomoléculas a nível do genoma. Foi inventado após a tecnologia RIP-Chip desenvolvida por Keene et al. em 1999. Seu protocolo relativamente curto e simples não requer o uso de equipamentos laboratoriais complexos. O sucesso da análise do RIP-Seq depende da otimização adequada da etapa de imunoprecipitação, pois isso dita a rigidez do tratamento para garantir que o componente de RNA não seja danificado e que os locais de ligação entre o RNA e a proteína não sejam destruídos.

Figura 1. Fluxo de trabalho do protocolo de sequenciação por imunoprecipitação de RNA. (Gagliardi, 2016)

Durante a Sequenciação por Imunoprecipitação de RNA, o complexo alvo RNA-proteína é precipitado com um anticorpo correspondente. A digestão por RNase é então realizada para remover sequências de RNA extras que não estão em contato com a proteína. O RNA resultante é então extraído e retrotranscrito para cDNA, que é então sequenciado e mapeado de volta ao genoma. Este processo pode ser usado para estudar complexos específicos de RNA-proteína com alta resolução na sequência de RNA diretamente ligada à proteína.

A tecnologia RIP-seq tem sido utilizada em diferentes estudos para entender a cascata de atividades dentro da célula. Werfel, et al. usaram esta técnica para estudar as atividades de microRNAs (miRNAs). Eles conseguiram demonstrar que a atividade do miRNA de mamíferos é influenciada pela ligação preferencial a uma região particular de 3', abrindo assim caminho para a regulação entre alvos potenciais. Bersani, et al. usaram a tecnologia para estudar o comportamento do Wig-1, uma proteína de ligação ao RNA que se liga e regula a expressão de múltiplos mRNAs. Seu estudo sugere novos locais de ligação para o Wig-1 e uma potencial correlação entre seus resultados e a resposta ao estresse e supressão de tumores.

A tecnologia RIP-seq provou sua utilidade em diferentes estudos relacionados ao controle epigenético e transcricional. Ela fornece uma visão sobre os mecanismos de ligação particulares das proteínas de ligação ao RNA, que podem ser usados para prever alvos de mRNAs. Também pode ser utilizada para estudar o desenvolvimento de doenças, incluindo câncer, e projetar novas terapias.

Referências:

1. Bersani, C., et al. Identificação em todo o genoma dos alvos de mRNA do Wig-1 pela análise de RIP-Seq. Oncotarget, 2015, 7(2).
2. Nicholson, C.O., Friedersdorf, M., Keene, J.D. Quantificando locais de ligação de RNA em todo o transcriptoma usando DO-RIP-seq. RNA Journal, 2016, 23(1).
3. Wessels, H., Hirsekorn, A., Ohler, U. et al, N. Identificando alvos de RBP com RIP-seq. Métodos em Biologia Molecular, 2016.
4. Gagliardi M., Matarazzo M.R. RIP: Imunoprecipitação de RNA. Em: Lanzuolo C., Bodega B. (eds) Proteínas do Grupo Polycomb. Métodos em Biologia Molecular, 2016.