Depleção de RNA Ribossómico para Protocolo de Sequenciação de RNA em Paralelo Massivo

Preparação de RNA Total

Realize o tratamento com Dnase do RNA total para remover a contaminação por DNA. O RNA total é isolado utilizando um Kit de RNA ou o Reagente TRIzol®. Ressuspenda o RNA total isolado em água tratada com DEPC conforme necessário. Verifique a qualidade do RNA total.

Passo de Hibridização

1. Ajuste um banho-maria ou bloco de aquecimento para 70-75°C.
2. Em um tubo de microcentrífuga estéril e livre de RNase de 1,5 mL, adicione RNA Total (0,5-10 mg) em menos de 10 mL, 8 mL de conjuntos de sondas bacterianas 16S e 23S (12,5 pmol/mL) e 100 mL de Tampão de Hibridização.
3. Incube o tubo a 70-75°C por 5 min para desnaturar o RNA.
4. Deixe a amostra esfriar lentamente até 37°C ao longo de 30 min, colocando o tubo em um banho-maria a 37°C. Não resfrie as amostras rapidamente colocando os tubos em água fria.

Preparação das Esferas

1. Ressuspenda as Esferas Magnéticas na sua garrafa original por meio de uma vortexação completa.
2. Pipete 750 mL da suspensão de esferas em um tubo de microcentrífuga estéril e livre de RNase de 1,5 mL.
3. Coloque o tubo com a suspensão de esferas em um separador magnético por 1 min. As esferas irão assentar no lado do tubo que está voltado para o ímã. Aspire suavemente e descarte o sobrenadante.
4. Adicione 750 mL de água DEPC às esferas e ressuspenda as esferas por vortexação lenta.
5. Coloque o tubo em um separador magnético por 1 min. Aspire e descarte o sobrenadante.
6. Repita os passos 4 e 5 uma vez.
7. Ressuspenda as esferas em 750 mL de Tampão de Hibridização e transfira 250 mL de esferas para um novo tubo, mantendo o tubo a 37°C para uso em um passo posterior.
8. Coloque o tubo com 500 mL de esferas em um separador magnético por 1 min. Aspire e descarte o sobrenadante.
9. Ressuspenda as esferas em 200 mL de Tampão de Hibridização e mantenha as esferas a 37°C até o uso.

Remoção de rRNA

1. Após a incubação a 37°C por 30 min da amostra hibridizada (acima), centrifugue brevemente o tubo para coletar a amostra no fundo do tubo.
2. Transfira a amostra (aproximadamente 118 mL) para as esferas magnéticas preparadas. Pipete para cima e para baixo ou vortexação em baixa velocidade para misturar bem.
3. Incube o tubo a 37°C por 15 min. Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo ocasionalmente. Centrifugue o tubo para coletar a amostra.
4. Coloque o tubo em um separador magnético por 1 min para pelotar o complexo rRNA. Não descarte o sobrenadante. O sobrenadante contém RNA.
5. Coloque o tubo com 250 mL de esferas do passo 7 em um separador magnético por 1 min. Aspire e descarte o sobrenadante.
6. A este tubo de esferas, adicione aproximadamente 318 mL de sobrenadante contendo RNA. Pipete para cima e para baixo ou vortexação em baixa velocidade para misturar bem.
7. Incube o tubo a 37°C por 15 min. Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo ocasionalmente. Colete a amostra no fundo do tubo centrifugando brevemente.
8. Coloque o tubo em um separador magnético por 1 min para pelotar o complexo rRNA-sonda. Não descarte o sobrenadante, pois o sobrenadante contém RNA.
9. Transfira o sobrenadante contendo RNA para um novo tubo.

Concentração

Concentração de RNA Usando Precipitação com Etanol

1. Transfira a amostra de RNA para um tubo de microcentrífuga limpo e livre de RNase de 1,5 mL ou 2 mL.
2. Adicione 1 mL de Glicogênio (20 mg/mL), 1/10 do volume da amostra (RNA eluído) de acetato de sódio 3 M, 2,5× volumes da amostra de etanol 100% aos componentes a seguir do RNA.
3. Misture bem e incube a −80°C por pelo menos 30 min.
4. Centrifugue o tubo por 15 min a 12.000 × g a 4°C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.
5. Adicione 500 mL de etanol a 70% frio.
6. Centrifugue o tubo por 5 min a 12.000 × g a 4°C. Descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet.
7. Repita os passos 5 e 6 uma vez.
8. Deixe o pellet secar ao ar por aproximadamente 5 min. Ressuspenda o pellet de RNA em 10-30 mL de água tratada com DEPC.
9. Coloque o RNA no gelo ou armazene o RNA a -80°C até o uso.

Referência:

1. Chen Z, Duan X. Depleção de RNA ribossômico para aplicações de sequenciamento de RNA bacteriano massivamente paralelo[M]//Sequenciamento de Próxima Geração de Alto Rendimento. Humana Press, Totowa, NJ, 2011: 93-103.