ITS e Sequenciação de Amplicons Fúngicos: Investigação de Comunidades Fúngicas em Solo, Raízes de Plantas e Amostras Clínicas

Um ecólogo de campo a amostrar raízes micorrízicas numa floresta temperada, um fitopatologista a acompanhar Fusarium murchar pelos campos de tomate, e um microbiologista clínico a perfilar o micobioma respiratório de indivíduos imunocomprometidos numa coorte de investigação partilham uma questão metodológica comum: que região do ADN ribossómico fúngico devo sequenciar, e que primers irão capturar a comunidade que realmente me interessa? A resposta raramente é simples — depende de saber se os seus fungos estão dentro das raízes das plantas, a viver livremente no solo, ou a colonizar as mucosas humanas.

Este artigo é um guia prático para a sequenciação de amplicões do espaçador transcrito interno (ITS) para a análise de comunidades fúngicas. Acompanhamos as decisões que determinam se um projeto de ITS produz uma taxonomia a nível de espécie resolvível, quais estratégias de extração e primers funcionam para cada matriz de amostra e como evitar as armadilhas mais comuns que transformam os dados da comunidade fúngica em listas ininterpretáveis de OTUs não classificadas. Para os investigadores que subcontratam a análise de comunidades fúngicas, Sequenciação de Amplicões 16S/18S/ITS na CD Genomics cobre todo o fluxo de trabalho de ITS, desde o controlo de qualidade da amostra até à classificação taxonómica.

Por que estudar fungos com ITS?

O reino fúngico é estimado em conter entre 2,2 a 3,8 milhões de espécies, das quais menos de 10% foram formalmente descritas. Eles são centrais no ciclo de carbono terrestre, na aquisição de nutrientes pelas plantas e — cada vez mais reconhecidos — na saúde e doença humanas. No entanto, a identificação de fungos por morfologia ou cultura é lenta, tendenciosa em relação a táxons esporulantes e cega a espécies inculturáveis. A identificação baseada em DNA resolve isso, e o espaçador interno transcrito (ITS) do operão de RNA ribossómico é o código de barras consensual.

A região ITS situa-se entre os genes de rRNA 18S (subunidade pequena) e 28S (subunidade grande). É transcrita, mas removida durante a maturação do rRNA, o que significa que acumula mutações a uma taxa mais rápida do que as regiões codificantes adjacentes — rápida o suficiente para discriminar espécies, mas conservada o suficiente dentro das espécies para servir como um código de barras fiável. A região ITS é dividida em ITS1 (entre 18S e 5.8S) e ITS2 (entre 5.8S e 28S), separadas pelo gene 5.8S altamente conservado.

Qual sub-região tem um desempenho melhor? A resposta depende do grupo fúngico. O ITS1 fornece uma resolução mais alta para Basidiomycota — o filo que inclui ferrugens, carvão e a maioria dos fungos formadores de cogumelos. O ITS2 supera o ITS1 para Ascomycota, o maior filo fúngico que abrange a maioria dos bolores, patógenos de plantas e leveduras clinicamente relevantes. Para estudos que visam ambos os filos de forma equitativa, a região completa do ITS (ITS1 + 5.8S + ITS2, aproximadamente 450-700 bp dependendo da espécie) oferece a maior cobertura taxonómica. O par de primers amplamente utilizado ITS1F/ITS4 amplifica a região completa do ITS e continua a ser a escolha mais comum para a perfuração de comunidades fúngicas gerais.

A base de dados UNITE é a referência central para a taxonomia de ITS de fungos. Ao contrário do SILVA ou do Greengenes2, que abrangem os três domínios da vida, o UNITE é curado especificamente para fungos e utiliza um sistema de agrupamento de hipótese de espécie (SH) dinâmico com limiares de identidade de 97-99%. Para a maioria dos projetos de ITS de fungos, a classificação contra o UNITE v9.0+ com um limiar de agrupamento de 97% fornece atribuições ao nível de espécie para grupos bem amostrados e atribuições ao nível de género para linhagens ambientais pouco caracterizadas.

Criticamente, saiba o que o ITS não pode fazer. O ITS não distingue de forma fiável estirpes dentro de uma espécie, não captura o conteúdo funcional dos genes e não funciona para eucariotas não fúngicos. Se a sua questão requer rastreio a nível de estirpe — rastreando um Fusarium oxysporum forma specialis em diferentes áreas, ou rastreando um Candida auris surto num hospital — A ITS por si só é insuficiente. Ela indica quais espécies estão presentes e as suas abundâncias relativas, mas não informa quais metabolitos estão a produzir ou se possuem genes de resistência a antifúngicos.

Figura 1: Estrutura da Região ITS no Operão rDNA Fúngico — Cobertura do ITS1 vs ITS2 e Resolução Taxonómica

Fluxo de Trabalho de Sequenciamento ITS

Extração de DNA: O Problema da Parede Celular Fúngica

As paredes celulares fúngicas são mais resistentes do que as paredes celulares bacterianas — os polímeros de quitina e glucano resistem aos protocolos de lise enzimática que funcionam bem para bactérias Gram-negativas. Os esporos são ainda mais recalcitrantes. A utilização de esferas de zircônia/sílica de 0,5 mm em um homogeneizador de alta velocidade (FastPrep ou Precellys) é o mínimo para recuperar DNA fúngico a partir de esporos e hifas melanizadas. Em uma comparação direta de métodos de extração para comunidades fúngicas do solo, os protocolos que utilizam lise mecânica (bater com esferas) recuperaram 40-60% mais OTUs fúngicos do que os protocolos apenas enzimáticos, e a diferença foi mais pronunciada para Ascomycota — o filo que inclui a maioria dos patógenos de plantas.

Para amostras de raízes de plantas, o desafio da co-extração funciona em ambas as direções. O DNA da planta pode dominar o extrato (o tecido radicular é >95% planta em massa), diluindo o sinal fúngico na sequenciação subsequente. A esterilização da superfície com 2% de hipoclorito de sódio, seguida de enxágues com água estéril, remove esporos fúngicos aderidos à superfície, mas preserva fungos endofíticos e micorrízicos dentro da raiz. Para o solo da rizosfera, a abordagem padrão é agitar vigorosamente as raízes em PBS estéril, coletar a suspensão de solo e extrair do pellet — isso enriquece a comunidade fúngica aderente à raiz sem sobrecarregar a amostra com DNA da planta.

Para amostras clínicas — líquido de lavagem broncoalveolar, swabs de pele, swabs vaginais — o DNA humano é o contaminante dominante. Ao contrário do 16S, onde o DNA do hospedeiro está ausente (os mamíferos não possuem genes 16S), os primers ITS não amplificam DNA humano porque os humanos não possuem o operão de rDNA fúngico. Isso significa que não é necessário um passo de depleção do hospedeiro para a PCR de ITS fúngico a partir de amostras clínicas humanas — uma vantagem prática distinta em relação ao 16S bacteriano, onde o DNA do hospedeiro pode competir com o template microbiano em amostras de baixo biomassa.

Primers de PCR: O Viés que Não Pode Evitar

Cada par de primers ITS tem pontos cegos taxonómicos. O ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA), amplamente utilizado, emparelhado com o ITS2 (GCTGCGTTCTTCATCGATGC), amplifica apenas o ITS1. Este par captura a maioria dos Ascomycota e Basidiomycota, mas amplifica de forma insuficiente linhagens fúngicas de divergência precoce (Chytridiomycota, Mucoromycota), que incluem fungos micorrízicos arbusculares nos Glomeromycota — indiscutivelmente o grupo fúngico mais ecologicamente significativo para a biologia das plantas.

Para estudos centrados em fungos micorrízicos arbusculares (FMA), o par de primers dedicado AML1/AML2 que almeja a região 18S ou primers ITS específicos para FMA (por exemplo, NS31/AML2) são superiores aos primers ITS fúngicos gerais. Os primers específicos para FMA capturam Glomeromycota que os primers ITS gerais perdem completamente. A desvantagem: os primers específicos para FMA não detectam fungos não-FMA, por isso é necessário uma estratégia de dois amplicons (ITS geral + específico para FMA) para um perfil abrangente da comunidade fúngica das raízes.

Para a região ITS2 especificamente, o par de primers ITS3/ITS4 (ou os modificados ITS3N/ITS4N) visa uma região de ~250-350 bp e tem a vantagem de menor variação de comprimento entre linhagens fúngicas em comparação com o ITS1, o que simplifica o processamento bioinformático e reduz o viés de comprimento da PCR. A classificação baseada em ITS2 utilizando a base de dados UNITE alcança atribuições a nível de espécie para 80-90% dos géneros fúngicos comumente encontrados em ambientes do solo e associados a plantas.

As condições de PCR são importantes. A amplificação do ITS fúngico utiliza normalmente entre 25 a 35 ciclos. Acima de 30 ciclos, o risco de formação de quimeras aumenta substancialmente. A temperatura de anelamento é crítica: 52-55°C proporciona o melhor equilíbrio entre rendimento e especificidade para ITS1F/ITS4; temperaturas de anelamento mais altas reduzem o rendimento de táxons sub-representados. Inclua sempre um controlo sem template e pelo menos um controlo positivo (uma comunidade fúngica simulada com composição conhecida) em cada placa de PCR.

Bioinformática: O Pipeline UNITE-QIIME 2

A bioinformática do ITS fúngico difere do 16S em dois aspectos importantes. Primeiro, os amplicons do ITS variam em comprimento: o ITS1 de uma espécie fúngica pode ter 200 bp, enquanto o ITS1 de outra pode ter 400 bp. Isso significa que os algoritmos padrão de fusão de extremidades pareadas que assumem um comprimento uniforme do amplicon precisam de ajustes. O fluxo de trabalho específico do ITS do DADA2 lida com isso cortando sequências de primers, filtrando com base em pontuações de qualidade e, em seguida, realizando desruído e fusão com restrições de comprimento mais flexíveis.

Em segundo lugar, a atribuição de taxonomia contra o UNITE utiliza um classificador específico para fungos, curado. O classificador UNITE compatível com QIIME 2 (disponível como arquivos .qza pré-treinados no site do UNITE) atribui taxonomia utilizando o sistema de hipótese dinâmica de espécies (SH). Para a maioria dos projetos, o classificador "dinâmico UNITE" treinado em 97% de OTUs proporciona o melhor equilíbrio entre resolução e precisão. A saída inclui identificadores SH (por exemplo, SH1234567.08FU) que ligam as suas sequências ao sistema de referência UNITE, permitindo uma comparação direta entre estudos.

A resolução ASV — produzindo variantes de sequência de amplicon em vez de clusters OTU — funciona para dados de ITS fúngico, mas requer cautela. A região ITS contém variantes intragenómicas dentro de um único genoma fúngico (múltiplas cópias de rDNA com sequências ITS ligeiramente diferentes; ambos os núcleos haploides em fungos dicarióticos podem conter diferentes alelos ITS), e o DADA2 pode separá-las em ASVs distintas. A pós-clusterização de ASVs a 97% de identidade recupera a resolução a nível de espécie que os ecologistas fúngicos esperam, sem a diversidade inflacionada das contagens brutas de ASV.

Figura 2: Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Amplicões ITS de Ponta a Ponta — Desde a Coleta de Amostras até o Perfil Taxonómico

Comunidades Fúngicas Associadas ao Solo e às Raízes

Redes Micorrízicas: A Economia Subterrânea

Os fungos micorrízicos arbusculares (AMF, filo Glomeromycota) formam simbioses com aproximadamente 80% das espécies de plantas terrestres. Eles expandem o sistema radicular da planta em ordens de magnitude, trocando fósforo e nitrogénio do solo por fotossintatos da planta. Os fungos ectomicorrízicos (ECM, principalmente Basidiomycota e Ascomycota) associam-se à maioria das espécies de árvores temperadas e boreais. Ambos os grupos são ecologicamente centrais e metodologicamente desafiadores de estudar — AMF porque não são capturados por primers gerais de ITS, e ECM porque o tecido fúngico está intermisto com células radiculares.

Para estudos focados em AMF, a estratégia é simples: utilizar primers específicos de AMF 18S (AML1/AML2 ou NS31/AML2) para o componente micorrízico e ITS geral para a comunidade fúngica mais ampla. Para estudos de ECM, primers ITS gerais funcionam bem em pontas de raízes ectomicorrízicas que foram dissecadas individualmente e agrupadas, mas amostras de raízes em bulk serão dominadas por fungos saprófitos e endofíticos.

As comunidades fúngicas do solo exibem uma heterogeneidade espacial extrema à escala do centímetro. Um único grama de solo florestal pode conter ADN de mais de 1.000 espécies de fungos, abrangendo saprófitos, patógenos e mutualistas. Para estudos de comunidades fúngicas do solo, a amostragem composta é essencial: colete 5-10 amostras de cada parcela, homogeneize e extraia de uma subamostra representativa. Para o solo da rizosfera especificamente, colete o solo que permanece preso às raízes após uma leve agitação; este é o compartimento da rizosfera, distinto do solo em massa a metros de distância.

Saúde do Solo Agrícola e Biocontrolo

As comunidades fúngicas do solo estão a ser cada vez mais utilizadas como indicadores da saúde do solo agrícola. Os fungos saprófitos — que decompõem os resíduos das culturas e ciclam nutrientes — tendem a aumentar sob gestão sem lavra e com o uso de culturas de cobertura. Os fungos patogénicos tendem a aumentar sob monocultura contínua. A razão entre os guildas funcionais de saprófitos e patófitos, inferida a partir de dados de ITS utilizando FUNGuild ou FungalTraits, fornece um índice quantitativo da saúde do solo que complementa as medições químicas.

Trichoderma as espécies estão entre os fungos de biocontrolo mais estudados. Elas parasitam patógenos fúngicos, produzem metabolitos secundários antimicrobianos e induzem resistência sistémica nas plantas. A sequenciação de ITS de amostras de solo em massa ou da rizosfera detecta Trichoderma a nível de género, mas a resolução a nível de espécie requer Sequenciação de Amplicões de 16S/18S/ITS de Comprimento Total ou marcadores adicionais (tef1, rpb2) porque a região ITS1 sozinha não resolve o Trichoderma harzianum complexo de espécies. Para identificação a nível de isolados, Identificação Microbiana serviços integram ITS com marcadores genéticos complementares.

Endófitos: A Comunidade Fúngica Dentro das Folhas e Caules

Endófitos foliares — fungos que vivem assintomaticamente dentro das folhas e caules das plantas — estão entre os componentes mais diversos e menos compreendidos do microbioma vegetal. Eles influenciam a tolerância à seca, a resistência a herbívoros e a suscetibilidade a patógenos. O sequenciamento de amplicões ITS tem sido a principal ferramenta para catalogar a diversidade de endófitos, uma vez que a maioria dos fungos endofíticos não pode ser cultivada em meios padrão.

O principal desafio na caracterização de ITS de endófitos é a descontaminação da superfície. As superfícies das folhas abrigam abundantes fungos epifíticos (leveduras, esporos de bolor) que são distintos da comunidade endofítica interior. A esterilização da superfície com hipoclorito de sódio a 2% (30-60 segundos), etanol a 70% (2 minutos) e três enxágues com água estéril é o padrão, mas o tempo de tratamento deve ser calibrado por espécie de planta — se for muito curto, os epifíticos persistem, se for muito longo, o esterilizante penetra na folha, matando os endófitos. A validação mais simples: colocar a água do último enxágue em ágar PDA e verificar o crescimento fúngico após 5 dias.

Vigilância de Patógenos de Plantas com ITS

Os patógenos fúngicos causam uma perda estimada de 10-23% nas colheitas a nível global, e as alterações climáticas estão a expandir a área geográfica de muitas espécies. O sequenciamento de amplicões ITS oferece duas vantagens para a vigilância de patógenos em relação aos métodos tradicionais: deteta patógenos antes de os sintomas aparecerem e captura o contexto completo da comunidade fúngica em que um patógeno opera.

Patógenos-chave Detectáveis por ITS

Fusarium espécies (Ascomycota: Hypocreales) causam murchas, podridões radiculares e queimas de cabeçalho em culturas de cereais, vegetais e ornamentais. O ITS resolve o Fusarium gênero limpo, mas discriminação a nível de espécie dentro do F. oxysporum e F. solani os complexos de espécies requerem o fator de elongação da tradução 1-alfa (tef1) gene. Para inquéritos onde saber "Fusarium "está presente com uma abundância relativa de X%" é suficiente, ITS funciona bem. Para estudos que requerem qual... Fusarium a espécie está a provocar a doença, emparelhe ITS com um Fusariummarcador específico de codificação de proteínas.

Verticillium dahliae e V. albo-atrum causa doenças de murcha em mais de 200 espécies de plantas. O ITS distingue entre as duas espécies de forma fiável, tornando o perfilamento de ITS do solo uma ferramenta prática de avaliação de risco pré-plantio. Uma amostra de solo com >1% Verticillium A abundância relativa por ITS prevê fortemente o desenvolvimento de murcha em culturas suscetíveis plantadas na estação seguinte.

Puccinia (os fungos de ferrugem, Basidiomycota) e outros biotróficos obrigatórios não podem ser cultivados em meios artificiais — a sequenciação do ITS diretamente a partir de tecido foliar infectado é o método de identificação mais prático. Os fungos de ferrugem têm regiões ITS incomumente grandes (o ITS1 pode exceder 500 bp), por isso, pares de primers que visam apenas o ITS2 (ITS3/ITS4) produzem uma amplificação mais consistente entre as espécies de ferrugem do que os pares de primers de ITS completo.

Sols Supressores de Doenças

Alguns solos agrícolas suprimem naturalmente patógenos fúngicos — um fenómeno impulsionado por membros antagónicos do microbioma do solo. A sequenciação ITS de solos supressores vs. favoráveis identificou um enriquecimento consistente de géneros fúngicos específicos.Chaetomium, Clonostachyse específico Trichoderma clados) em solos supressores. Para agricultores e agrónomos, o perfilamento de ITS do solo de campo pode identificar campos com comunidades fúngicas naturalmente supressoras que podem necessitar de menos aplicação de fungicidas — uma aplicação de agricultura de precisão que está a passar da investigação para a prática comercial.

Figura 3: Comunidades de Fungos do Solo e das Raízes — Redes Micorrízicas e Interacções com Patógenos

O Micobioma Humano na Saúde e na Doença

O corpo humano abriga comunidades fúngicas (o micobioma) em todas as superfícies mucosas — cavidade oral, trato respiratório, trato gastrointestinal, trato vaginal e pele. O micobioma é muito inferior em biomassa em comparação com o bacterioma (os fungos representam <0,1% do total de genes microbianos nas fezes), e essa baixa abundância cria desafios técnicos únicos para a caracterização baseada em ITS.

Micobioma Intestinal

No intestino saudável humano, Cândida, Saccharomyces, e Malassezia os géneros fúngicos dominantes detetados pela sequenciação de ITS, mas a variação interindividual é muito maior do que a das bactérias intestinais — o perfil fúngico intestinal de uma pessoa é mais semelhante a uma impressão digital do que a um tipo de comunidade conservada. Estudos longitudinais mostram que as comunidades fúngicas intestinais flutuam de forma mais dinâmica do que as comunidades bacterianas ao longo de dias a semanas, refletindo provavelmente a ingestão de fungos dietéticos (cascas de queijo, pão, alimentos fermentados) e a passagem transitória de fungos ambientais.

Para estudos do micobioma intestinal, os protocolos de extração de DNA de fezes otimizados para bactérias (por exemplo, DNeasy PowerSoil Pro) recuperam adequadamente o DNA fúngico, mas a baixa razão entre DNA fúngico e bacteriano significa que o sequenciamento de amplicões ITS fúngicos requer um maior número de ciclos de PCR (35-40 ciclos) para gerar um rendimento de biblioteca suficiente. A consequência é o aumento da formação de quimeras e a deriva de PCR — réplicas biológicas e controles negativos são mais importantes para o ITS fúngico do que para o 16S bacteriano a partir da mesma amostra de fezes.

Micobioma Respiratório

O trato respiratório inferior foi durante muito tempo considerado estéril, mas a sequenciação de ITS do líquido de lavagem broncoalveolar (BAL) revelou uma comunidade fúngica de baixa biomassa dominada por fungos ambientais.Cladosporium, Penicillium, Aspergillus) em indivíduos saudáveis. Em pacientes com fibrose cística, asma ou DPOC, o micobioma respiratório altera-se — Aspergillus fumigatus e Candida albicans são os colonizadores fúngicos mais comuns, e a sua presença está associada a um declínio acelerado da função pulmonar na fibrose cística.

O desafio técnico dominante para os estudos do micobioma respiratório é controlar a contaminação das vias aéreas e dos reagentes. A biomassa fúngica no líquido de lavagem broncoalveolar (BAL) está na ordem dos picogramas, tornando os brancos de extração e os controlos sem template de PCR indispensáveis. Num estudo bem controlado, os táxons fúngicos que aparecem nos controlos negativos (tipicamente Cladosporium, Alternaria, e Penicillium — fungos aéreos comuns) devem ser subtraídos ou excluídos da análise. Sem esta etapa, o micobioma respiratório reportado é predominantemente um catálogo de contaminantes do ar do laboratório e dos kits.

Micobioma Oral e Cutâneo

A caracterização oral do ITS identifica consistentemente Cândida como o gênero fúngico dominante na cavidade oral, mas Malassezia, Aspergillus, e Fusarium também aparecem em menor abundância. O transporte de levedura oral aumenta com o uso de dentaduras, xerostomia (boca seca) e imunossupressão. Amostras de enxaguatório bucal ou esfregaço da língua funcionam bem para o perfilamento ITS — não são necessários dispositivos de coleta especializados, e a alta carga fúngica nas amostras orais significa que 25-30 ciclos de PCR são suficientes.

Malassezia domina o micobioma da pele, particularmente no rosto, couro cabeludo e parte superior do tronco — regiões ricas em glândulas sebáceas. Malassezia as espécies são dependentes de lípidos, e a sua abundância correlaciona-se com a produção de sebo. O ITS1 é suficiente para Malassezia identificação a nível de espécie para as espécies comuns (M. restricta, M. globosa, M. sympodialis), mas espécies mais raras no gênero beneficiam-se do sequenciamento do ITS2 ou do ITS de comprimento total.

Figura 4: Micobioma Humano — Principais Locais do Corpo e Taxas Fúngicas Dominantes por Perfilagem de ITS

Escolhendo a Sua Estratégia de ITS

ITS1 vs. ITS2: Recomendação Final

Escolha ITS1 (par de primers ITS1F/ITS2) se o seu estudo se destina a Basidiomycota (ferrugens, carunchos, fungos micorrízicos, fungos de decomposição de madeira), se precisar de máxima compatibilidade com o maior número de conjuntos de dados ITS publicados, ou se as suas amostras forem de solo ou associadas a plantas onde a diversidade de Basidiomycota é alta.

Escolha ITS2 (par de primers ITS3/ITS4 ou ITS3N/ITS4N) se o seu estudo se destina a Ascomycota (bolores, patógenos de plantas, leveduras), se estiver a trabalhar com o micobioma humano onde a maioria dos fungos clinicamente relevantes são Ascomycota, ou se valoriza a menor variação no comprimento do amplicão que simplifica o processamento bioinformático.

Escolha o ITS completo (ITS1F/ITS4) se precisar de uma máxima amplitude taxonómica em todos os filos de fungos e a sua plataforma de sequenciação suportar amplicões de até 700 bp (MiSeq v3 2×300 bp com sobreposição; PacBio; Nanopore).

Figura 5: Quadro de Decisão ITS1 vs ITS2 — Escolhendo a Estratégia de Amplicon Certa

Profundidade de Sequenciamento e Réplicas Biológicas

As bibliotecas de ITS fúngicos da maioria dos tipos de amostras atingem a saturação entre 50.000-100.000 leituras por amostra — semelhante ao 16S bacteriano. Amostras de solo, que contêm as comunidades fúngicas mais diversas, podem exigir entre 100.000-150.000 leituras para a saturação da curva de rarefação.

Os requisitos de réplicas biológicas espelham aqueles para 16S: 5-8 por grupo para estudos de plantas em ambiente controlado (com vaso ou parcela como unidade experimental), 20-30 por grupo para estudos de micobioma humano transversais, e 8-12 por tratamento para estudos agrícolas em escala de campo. Réplicas técnicas geralmente acrescentam informação negligenciável para ITS, assim como para 16S.

Fatores de Custo e Planeamento Orçamental

O custo por amostra do sequenciamento de amplicons ITS caiu substancialmente, mas o custo total vai além do sequenciamento em si. Ao orçamentar para um projeto de ITS, os principais componentes de custo são a extração de DNA (mais elevada para amostras de solo e plantas que requerem limpeza adicional), amplificação por PCR e preparação de bibliotecas (um amplicon para apenas ITS, dois amplicons para ITS + 16S), profundidade de sequenciamento (50K-150K leituras por amostra, dependendo do tipo de amostra) e análise bioinformática (classificação taxonómica UNITE padrão vs. previsões funcionais personalizadas). Como um guia aproximado para orçamentação de subsídios: um projeto de 50 amostras apenas de ITS com extração de DNA de solo padrão através de bioinformática básica normalmente fica na faixa de $50-100 por amostra na maioria dos CROs, enquanto um projeto de ITS + 16S adiciona 30-50% ao custo por amostra.

Nota: O preço exato depende do tipo de amostra, qualidade do DNA e nível de análise. Solicite sempre um orçamento tudo incluído que cubra a extração até a bioinformática, e confirme que as amostras estão randomizadas entre as placas de sequenciação para evitar efeitos de lote.

Integração de ITS com 16S e Outras Abordagens

Um número crescente de estudos sequencia tanto ITS como 16S a partir das mesmas amostras — perfis de comunidades fúngicas e bacterianas a partir do mesmo extrato de DNA, amplificados com conjuntos de primers separados. Esta abordagem de duplo marcador captura a comunidade microbiana completa e revela interações fúngico-bacterianas que nenhum dos marcadores isoladamente consegue detetar. Ao planear um estudo dual de ITS + 16S, extraia DNA suficiente para dividir em dois alíquotas para amplificação PCR separada, em vez de tentar multiplexar ambos os conjuntos de primers numa única reação.

Um projeto dual de ITS + 16S com 50 amostras custa tipicamente 30-50% mais do que um projeto de marcador único do mesmo tamanho — o custo adicional provém da segunda amplificação por PCR, da segunda preparação da biblioteca e da profundidade de sequenciação adicional necessária para alcançar uma cobertura adequada para ambos os amplicões. No entanto, o custo combinado por amostra para ambos os marcadores permanece bem abaixo de um metagenoma shotgun raso (5M leituras por amostra), tornando a sequenciação de amplicões de marcadores duplos a abordagem mais económica para um perfil abrangente da comunidade bacteriana-fúngica. Ao solicitar orçamentos a uma CRO, confirme que ambos os amplicões podem ser sequenciados na mesma célula de fluxo para maximizar a eficiência de custos e esclareça se a análise bioinformática para ambos os marcadores (UNITE para ITS, SILVA para 16S) está incluída no pacote de análise padrão ou cobrada separadamente.

Se a sua pergunta exige anotação funcional — o que estes fungos estão a fazer? — a sua taxonomia ITS por si só não a responderá. Sequenciação Metagenómica por Shotgun captura genomas fúngicos juntamente com genomas bacterianos, fornecendo anotação funcional direta de genes, incluindo perfis de enzimas ativas em carboidratos (CAZy) e clusters de genes biossintéticos de metabolitos secundários. Para estudos de interação planta-fungo onde o transcriptoma do hospedeiro também é de interesse, RNA-Seq captura tanto a expressão genética das plantas como a expressão genética dos fungos a partir de tecido infectado simultaneamente. Se precisar de resolução a nível de espécie além do que o ITS padrão fornece — para resolver complexos de espécies em Fusarium, Trichodermaou Cândida — Sequenciação de Amplicões de Comprimento Total 16S/18S/ITS usar plataformas PacBio ou Nanopore fecha a lacuna de resolução.

Para uma perspetiva mais ampla sobre como o ITS se encaixa na paisagem de sequenciação de amplicões de múltiplos marcadores — incluindo 16S para bactérias, 18S para protistas e código de barras de DNA para identificação de espécies — consulte o artigo. Serviços de Sequenciação de Amplicons para Pesquisa de Microbioma e Biodiversidade: Soluções de 16S, 18S, ITS e Codificação de DNAPara a identificação a nível de espécie de isolados fúngicos individuais (em vez de perfis de comunidade), os Serviços de Código de Barras de DNA para Identificação de Espécies: COI, rbcL, matK e Além oferecem abordagens complementares.

CD Genomics' Serviços de Sequenciação de Amplicons apoio a projetos de marcador único (ITS ou 16S) e de marcador duplo, com pipelines bioinformáticos padronizados UNITE + SILVA e opções de análise personalizadas para estudos de comunidades fúngicas. Para investigadores que necessitam de abundância fúngica absoluta em vez de proporções relativas, Sequenciação de Amplicões Absoluta Quantitativa 16S/18S/ITS adiciona padrões de spike-in para converter as contagens de leitura ITS em números absolutos de células fúngicas por amostra.

Perguntas Frequentes

Q: Qual é melhor para o perfilamento da comunidade fúngica — ITS1 ou ITS2?

O ITS1 proporciona uma melhor resolução para Basidiomycota; o ITS2 para Ascomycota. Para uma cobertura equilibrada em todo o reino fúngico, o ITS completo (ITS1F/ITS4, ~450-700 bp) é a melhor escolha. Se restrições técnicas limitarem o comprimento do amplicão, o ITS2 (~250-350 bp) oferece uma menor variação de comprimento e uma amplificação mais uniforme entre as linhagens fúngicas.

P: Os primers ITS gerais podem detectar fungos micorrízicos arbusculares (FMA)?

Não, não de forma fiável. O primer ITS1F amplamente utilizado tem incompatibilidades com Glomeromycota. Para estudos focados em AMF, utilize primers específicos de 18S para AMF (AML1/AML2 ou NS31/AML2) em paralelo com primers gerais de ITS para a comunidade fúngica mais ampla.

Q: Como posso evitar que o DNA das plantas domine as minhas bibliotecas de ITS de fungos radiculares?

Desinfetar superficialmente as raízes com hipoclorito de sódio a 2% (30-60 segundos), enxaguar com água estéril e extrair DNA diretamente do tecido radicular. Os primers ITS não amplificam DNA de plantas (as plantas não possuem o operão rDNA fúngico), mas compostos de plantas co-extraídos (polifenóis, polissacarídeos) podem inibir a PCR. A limpeza pós-extração com PVP ou esferas SPRI melhora a amplificação a partir de extratos derivados de plantas.

Q: Quais controlos negativos são essenciais para o sequenciamento de ITS de fungos?

Os mesmos três controlos que para 16S: branco de extração (controlo sem amostra processado através de todo o fluxo de trabalho de extração), branco de PCR (água de grau molecular substituída pelo template de DNA) e branco de campo (um swab estéril ou dispositivo de coleta exposto ao ambiente de amostragem). Os projetos de ITS fúngico são especialmente sensíveis à contaminação por esporos transportados pelo ar — Cladosporium, Penicillium, e Alternaria aparecem frequentemente em controlos negativos.

Q: Quantas leituras por amostra preciso para ITS?

50.000-100.000 para a maioria dos tipos de amostras. Amostras de solo no extremo superior (100.000-150.000). Amostras do micobioma humano (fezes, pele, oral) no extremo inferior (30.000-50.000) devido à menor diversidade fúngica.

P: Posso usar o mesmo extrato de DNA para sequenciação de ITS e 16S?

Sim. O ADN extraído com protocolos de batimento de esferas (por exemplo, DNeasy PowerSoil Pro) recupera tanto ADN bacteriano como fúngico. Divida o extrato em dois alíquotas para amplificação separada de ITS e 16S por PCR. Não multiplexe ambos os conjuntos de primers numa única reação de PCR — os primers irão interferir uns com os outros.

Q: Quão fiável é o ITS para a identificação a nível de espécie de fungos clínicos?

Confiável para fungos clínicos comunsCandida albicans, C. glabrata, Aspergillus fumigatus, A. niger, Cryptococcus neoformans) ao usar o UNITE como base de dados de referência. Para fungos clínicos menos comuns ou complexos dentro da mesma espécie (por exemplo, Candida parapsilosis complexo), o ITS pode apenas resolver ao nível de género ou complexo de espécies.

Q: Que pipeline de bioinformática devo usar para dados de ITS de fungos?

DADA2 com o fluxo de trabalho específico para ITS (cortar primers, filtrar, desruído, mesclar com restrições de comprimento relaxadas), seguido pela atribuição de taxonomia contra o classificador dinâmico UNITE (formato .qza compatível com QIIME 2). ASVs pós-cluster a 97% de identidade para colapsar variantes intragenómicas em unidades a nível de espécie.

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Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.