Exploração de Padrões e Mecanismos do Ciclo do Azoto através de Sequenciação Metagenómica

O ciclo do nitrogénio é um dos ciclos biogeoquímicos mais importantes da Terra, com os microrganismos a desempenharem um papel indispensável na sua complexa rede. Ao aproveitar o poder das tecnologias metagenómicas, desbloqueamos uma visão abrangente tanto da quantidade pura como da diversa gama de táxons microbianos funcionais interligados dentro do ciclo do nitrogénio. Consequentemente, obtemos profundas percepções sobre os padrões subjacentes e os mecanismos intrincados que governam este ciclo fundamental.

Visão geral dos processos do ciclo do nitrogénio por genes marcadores selecionados. (de Jong et al., 2018)

Ciclo do Nitrogénio

O nitrogénio, um elemento essencial para a vida, é considerado um dos principais fatores limitantes para o crescimento biológico no nosso planeta. Embora o nitrogénio atmosférico (N2) seja abundante, a maioria dos organismos depende de formas de nitrogénio biodisponíveis, como o amónio e o nitrato, para impulsionar o seu crescimento. A disponibilidade destas formas de nitrogénio depende de uma série de reações de transformação de nitrogénio intrincadas, coletivamente referidas como o ciclo do nitrogénio. Este ciclo orquestra o movimento, a alteração e a reciclagem perpétua do nitrogénio elementar entre a atmosfera, a biosfera, o solo e a hidrosfera da Terra.

O ciclo do nitrogénio pode ser dissecado em seis processos distintos de transformação de nitrogénio, cada um com um propósito único:

• Assimilação: Os organismos convertem formas inorgânicas de nitrogénio (por exemplo, sais de amónio e nitratos) em nitrogénio orgânico, um recurso vital para o crescimento e síntese em entidades vivas.
• Amonificação: A decomposição de compostos orgânicos de nitrogénio em sais de amónio marca a conversão de nitrogénio orgânico para inorgânico.
• Nitrificação: Um processo de conversão em que os sais de amónio se metamorfoseiam em nitratos, apresentando dois sub-processos: oxidação de amónia e oxidação de nitrito.
• Desnitrificação: O nitrato sofre redução para nitrogénio elementar (N2), libertando nitrogénio na atmosfera.
• Oxidação Anaeróbica de Amónia (Anammox): Um caminho de transformação de nitrogénio especializado que converte diretamente amónio e nitrato em gás nitrogénio, contornando intermediários.
• Fixação de Nitrogénio: O nitrogénio atmosférico (N2) é convertido em formas de nitrogénio biologicamente acessíveis, como sais de amónio.

Os fluxos entre estes processos de transformação de nitrogénio exibem considerável variação, sendo a conversão entre amónia e nitrogénio orgânico um dos processos de fluxo mais elevados, enquanto a nitrificação se destaca como um importante contribuinte para o fluxo.

Metagenómica na Pesquisa do Ciclo do Nitrogénio

As tecnologias metagenómicas emergiram como ferramentas indispensáveis na desvendar dos mistérios dos microrganismos e dos seus genes associados dentro do ciclo do nitrogénio. Os seguintes pontos destacam facetas e bases de dados chave integradas em estudos metagenómicos focados no ciclo do nitrogénio:

• Identificação de Genes Associados ao Ciclo do Nitrogénio: A mineração de dados metagenómicos facilita a descoberta de genes associados ao ciclo do nitrogénio que residem no ambiente natural. Estes genes codificam enzimas e proteínas cruciais para a transformação do nitrogénio.
• Quantificação da Abundância de Genes: Os dados metagenómicos permitem-nos avaliar a abundância relativa de genes relacionados com o ciclo do nitrogénio entre diversos grupos microbianos, iluminando assim a sua importância nos ecossistemas.
• Distribuição de Espécies de Genes Associados: Os dados metagenómicos fornecem percepções sobre a distribuição de genes relacionados com o ciclo do nitrogénio entre várias espécies microbianas, lançando luz sobre o papel da diversidade microbiana na formação da intrincada tapeçaria do ciclo do nitrogénio.

Base de Dados do Ciclo do Nitrogénio

As bases de dados fornecem coletivamente uma rica fonte de informação genética relacionada com o ciclo do nitrogénio, permitindo que os investigadores aprofundem as complexidades do metabolismo do nitrogénio e dos seus genes associados. As bases de dados especializadas (NcycFunGen e NCycDB) oferecem recursos abrangentes e fáceis de usar, enquanto o KEGG fornece contexto adicional, mas pode exigir uma navegação mais intrincada, especialmente para dados de genes incompletos. Os investigadores podem escolher a(s) base(s) de dados mais adequada(s) com base nas suas necessidades de pesquisa específicas e na completude das suas sequências de genes.

Base de Dados NcycFunGen

Esta base de dados inestimável abriga uma coleção substancial de dados genéticos, abrangendo 60.735 sequências de aminoácidos, sequências de ácidos nucleicos e perfis HMM de 22 genes fundamentais associados ao ciclo do nitrogénio.

Os investigadores podem aproveitar estes recursos para uma multitude de propósitos. As sequências de aminoácidos podem ser organizadas em bibliotecas de sequências mmseqs, facilitando a indexação sistemática. A correspondência de homologia pode então ser aplicada para uma anotação detalhada. Além disso, os espectros HMM podem ser utilizados para buscas de sequências espectrais e anotação abrangente de sequências de Quadro de Leitura Aberto (ORF).

A base de dados também oferece um mapeamento de sequências de aminoácidos para os seus respetivos símbolos de genes, simplificando a exploração dos genes do ciclo do nitrogénio.

Base de Dados NCycDB

A base de dados NCycDB é um tesouro que compreende 273.942 sequências de aminoácidos, que são refinadas para 273.501 ao eliminar identificadores de sequências duplicadas. Estas sequências correspondem a um total de 68 genes únicos associados ao ciclo do nitrogénio.

Os investigadores podem explorar este recurso para uma ampla gama de aplicações. A base de dados de sequências de aminoácidos fornece uma fundação abrangente para investigações genómicas. Além disso, a base de dados oferece um mapeamento valioso que associa sequências de aminoácidos com os seus símbolos de genes correspondentes.

Base de Dados KEGG

KEGG, um recurso de bioinformática renomado, apresenta uma variedade de genes relacionados com o ciclo do nitrogénio, que estão ligados a KOs do KEGG (Ortologia KEGG).

Os dados extensos do KEGG podem ser utilizados para aceder a espectros HMM de KOs do KEGG, oferecendo percepções sobre as funções dos genes. Além disso, fornece acesso a sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos associadas a genes do KEGG.

Embora o KEGG seja um recurso valioso, é importante notar que pode gerar menos resultados de anotação em comparação com bases de dados especializadas como NcycFunGen e NCycDB. Em particular, o método kofamscan do KEGG pode revelar-se menos amigável, especialmente para sequências de genes incompletas.

Caso: Estudo do Ciclo do Nitrogénio em Ambientes de Cold Seep através de Sequenciamento Metagenómico

A Enigma dos Diazotróficos em Sedimentos de Cold Seep

Pesquisas recentes identificaram arqueias metanotróficas anaeróbicas (ANME-2) e os seus parceiros bacterianos redutores de sulfato (clado SEEP-SRB1) como pioneiros diazotróficos em sedimentos de cold seep de águas profundas. Estes organismos notáveis, através das suas capacidades de fixação de nitrogénio, desafiam as condições adversas do ambiente de cold seep. No entanto, uma questão premente pairava: Serão ANME-2 e SEEP-SRB1 os únicos campeões da fixação de nitrogénio neste abismo gelado?

A Busca por Perspectivas Abrangentes

Para desvendar as dimensões ocultas do ciclo do nitrogénio em cold seeps, esta equipe intrépida embarcou numa busca. Armados com técnicas de sequenciamento metagenómico de ponta, coletaram e analisaram dados de 61 metagenomas, 1428 genomas montados a partir de metagenomas e seis metatranscriptomas extraídos de 11 locais de cold seep em todo o mundo. A sua missão: decifrar a intrincada rede do ciclo do nitrogénio nestas profundezas misteriosas.

Árvore filogenética de máxima verossimilhança da subunidade não redundante da nitrogenase NifH identificada a partir de montagens metagenómicas de cold seep. (Dong et al., 2022)

Revelando a Diversidade de Linhagens Diazotróficas

A jornada metagenómica revelou uma revelação notável—uma diversidade de genes de nitrogenase abrangendo uma vasta diversidade de linhagens diazotróficas aninhadas dentro dos sedimentos de cold seep. A capacidade de fixação de nitrogénio, parecia, não estava confinada apenas a ANME-2 e SEEP-SRB1. Em vez disso, uma rica tapeçaria de grupos microbianos emergiu como potenciais fixadores de nitrogénio, reescrevendo a narrativa do ciclo do nitrogénio nestes ambientes extremos.

Desbloqueando os Mecanismos

A busca não parou na descoberta de genes; eles aprofundaram-se ainda mais na maquinaria metabólica que impulsiona a fixação de nitrogénio. Previsões de diversas vias catabólicas sugeriram os meios pelos quais estes microrganismos de cold seep alimentavam as suas capacidades de fixação de nitrogénio, desafiando a noção prevalecente de que a diazotrofia nestes ambientes estava intrinsecamente ligada à oxidação anaeróbica de metano dependente de sulfato.

Reconstrução metabólica de vias principais para MAGs fixadores de nitrogénio. (Dong et al., 2022)

Mobilidade Genética e Forças Evolutivas

Intrigantemente, foram descobertas evidências de mobilidade genética entre os genes de fixação de nitrogénio dentro dos grupos diazotróficos em cold seeps. Além disso, as forças da evolução, na forma de seleção purificadora, pareciam moldar estas características genéticas. Isso sugeriu uma comunidade de fixadores de nitrogénio dinâmica e adaptável no ecossistema de cold seep.

Expandindo o Horizonte

As suas descobertas ultrapassaram os limites da pesquisa sobre o ciclo do nitrogénio em ambientes de cold seep. Cinco filos candidatos, Altarchaeia, Omnitrophota, FCPU426, Caldatribacteriota e UBA6262, emergiram como potenciais diazotróficos, expandindo a lista de organismos fixadores de nitrogénio nestes habitats remotos e adversos. Estes fixadores de nitrogénio anteriormente negligenciados poderiam, postularam, ser contribuintes substanciais para o equilíbrio global de nitrogénio.

Referências:

1. Dong, Xiyang, et al. "Diazotróficos filogeneticamente e catabolicamente diversos residem em sedimentos de cold seep de águas profundas." Nature Communications 13.1 (2022): 4885.
2. de Jong, Anniek, et al. "Diminuição da diversidade microbiana ao longo de um gradiente de poluição no sedimento do rio Citarum." BioRxiv (2018): 357111.