Diretrizes para Submissão de Amostras
Estratégias para Mitigar a Contaminação Comum de DNA na Sequenciação Microbiana
O campo da investigação de comunidades microbianas transformou a nossa compreensão da microbiologia, no entanto, o problema generalizado da contaminação por DNA pode comprometer a integridade dos experimentos, desde a amostragem inicial até à fase final de sequenciação. Contaminantes podem infiltrar-se nas amostras de DNA durante várias etapas de pesquisa microbiana, incluindo extração de DNA, amplificação por PCR e até mesmo reagentes de laboratório, distorcendo, em última análise, os resultados. Em particular, a contaminação por DNA pode ser prejudicial ao estudar amostras com cargas microbianas mínimas, exigindo medidas cuidadosas para enfrentar este desafio.
Fontes de Contaminação de DNA
As fontes potenciais de contaminação de DNA são múltiplas e incluem água de grau biológico molecular, reagentes de PCR e os próprios kits de extração de DNA. Para discernir e quantificar os níveis de contaminação, controles negativos, frequentemente referidos como amostras de extração de DNA "em branco" e subsequente amplificação por PCR, são rotineiramente incluídos em sequenciação microbiana experimentos. Curiosamente, estas amostras de controlo negativo revelam tipicamente um espectro de espécies bacterianas contaminantes, refletindo o fundo encontrado em amostras de origem humana processadas juntamente com o mesmo lote de kits de extração de ADN.
Uma análise destes resultados de controlo negativo revela frequentemente classificações taxonómicas comuns em diferentes locais de laboratório. Entre os contaminantes recorrentes estão Acidobacteria Gp2, Burkholderia, Mesorhizobiume PseudomonasEstas semelhanças sugerem que existem variações nos níveis de contaminantes entre laboratórios, potencialmente resultantes de diferenças nos reagentes, lotes de kits ou até mesmo contaminantes introduzidos no ambiente do laboratório.
Resumo da atribuição taxonómica do sequenciamento do gene 16S rRNA a partir de culturas puras diluídas em dez vezes e controlos. (Salter et al., 2014)
Impacto dos Kits de Extração Contaminados em Estudos de Baixa Biomassa
Para ilustrar a gravidade da questão, vamos considerar um caso específico. Foram utilizados swabs nasofaríngeos para investigar a evolução da microbiota nasofaríngea em bebés. A Análise de Coordenadas Principais (PCoA) revelou dois táxons distintos, com amostras recolhidas durante os primeiros seis meses de vida claramente distinguíveis daquelas recolhidas em estágios posteriores. Esta descoberta sublinha a correlação entre a flora bacteriana nasofaríngea e o tempo de desenvolvimento. No entanto, uma variável crucial surgiu quando foram utilizados quatro lotes diferentes de kits de extração de DNA. A escolha do kit influenciou marcadamente as características da comunidade das amostras, com a maioria das leituras das amostras a originar-se dos dois primeiros kits utilizados.
Resumo do conteúdo de contaminantes em amostras nasofaríngeas da Tailândia. (Salter et al., 2014)
Recomendações
Dadas as profundas implicações da contaminação por DNA bacteriano em estudos microbianos, especialmente ao lidar com amostras de baixa biomassa microbiana, surge um conjunto de recomendações-chave:
Consistência do Kit: Para minimizar a contaminação introduzida pelos próprios kits, é fortemente aconselhável utilizar o mesmo lote de kits de extração de DNA de forma consistente ao longo de um projeto. Esta prática garante uniformidade e elimina o risco de variação nos resultados induzida pelo kit.
Conclusão
A batalha contra a contaminação do ADN em sequenciação microbiana é um esforço contínuo, vital para a fiabilidade e reprodutibilidade dos estudos de microbiota. Ao compreender as fontes de contaminação, reconhecer o seu impacto nos resultados e implementar medidas como a consistência dos kits, os investigadores podem salvaguardar a integridade da sua pesquisa sobre comunidades microbianas, mesmo ao lidar com amostras de baixa biomassa microbiana. Esta abordagem levará, em última análise, a descobertas mais precisas e fiáveis, avançando ainda mais a nossa compreensão da microbiologia.
Referência:
- Salter, Susannah J., et al. "Contaminação de reagentes e laboratórios pode impactar criticamente análises de microbioma baseadas em sequências." BMC biologia 12 (2014): 1-12.
