Protocolo de Sequenciação de DNA Livre de Células Sanguíneas em Plasma

1. Cole 5mL de sangue periférico utilizando tubos de sangue EDTA separados.
2. Extraia o plasma materno por um procedimento de centrifugação em duas etapas dentro de 8 horas após a coleta de sangue. Resumidamente, centrifugue o sangue materno inicialmente a 1600×g durante 10 minutos a 4°C e transfira 1 ml do sobrenadante para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml para uma segunda centrifugação a 16000×g durante 10 minutos a 4°C. Em seguida, transfira a maior parte do plasma materno para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml. Tenha cuidado para não remover qualquer camada de leucócitos ou detritos do fundo ao transferir o plasma materno.
3. Extrair cfDNA de 300μL de plasma materno utilizando um Kit de Isolamento de DNA Circulante, seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, misturar 20μL de Proteinase K e 25μL de Pure Particle G com 300μL de plasma materno num novo tubo Eppendorf de 1,5ml. Misturar bem e adicionar 550μL de Lysis Buffer. Vortexar brevemente e colocar o tubo Eppendorf num dispositivo de separação magnética durante 15 minutos à temperatura ambiente.
4. Remova cuidadosamente todo o sobrenadante e misture as esferas restantes com 700 μL de Buffer de Lavagem 1. Vortex brevemente e coloque o tubo Eppendorf num dispositivo de separação magnética durante 1 min.
5. Remova cuidadosamente todo o sobrenadante e misture as esferas restantes com 700 μL de Buffer de Lavagem 2 (certifique-se de que o etanol foi adicionado). Vortex brevemente e coloque o tubo Eppendorf num dispositivo de separação magnética durante 1 min.
6. Remova cuidadosamente todo o sobrenadante e repita a lavagem com 700 μL de Tampão de Lavagem 2. Coloque o tubo Eppendorf num dispositivo de separação magnética para remover cuidadosamente todo o sobrenadante e, em seguida, deixe à temperatura ambiente a secar durante 10 minutos.
7. Adicione 50 μL de tampão de eluição, agite brevemente, e deixe à temperatura ambiente durante 5 minutos. Coloque o tubo Eppendorf em um dispositivo de separação magnética e remova o sobrenadante para um novo tubo Eppendorf.
8. Determine a quantificação do cfDNA plasmático extraído utilizando um kit Qubit ds DNA HS Assay, e determine o tamanho dos fragmentos de DNA utilizando um kit Agilent 2100 numa plataforma Bioanalyzer 2100. O cfDNA plasmático deve apresentar um pico de fragmento entre 166–170 bp.
9. Construa a biblioteca de cfDNA utilizando um Conjunto de Preparação de Biblioteca de DNA Livre de Células, seguindo as instruções do fabricante. Utilize 5 ng de cfDNA para realizar a reparação das extremidades e a adição de A. Adaptadores com códigos de barras específicos são ligados aos fragmentos de cfDNA, e em seguida, o produto da ligação é purificado com as Beads de Purificação fornecidas.
10. Após a limpeza, o DNA é amplificado por 12 ciclos de PCR e outra ronda de purificação seguindo as instruções do kit. Quantifique os produtos de PCR com o Kit de Análise de dsDNA HS. O rendimento necessário para os produtos de PCR é ≥2 ng/μL.
11. Desnaturar os produtos da PCR a 95 °C durante 3 minutos num termociclador PCR. Misturar o DNA desnaturado com a Mistura de Reação de Circularização e incubar a 37 °C durante 30 minutos para criar círculos de DNA de cadeia simples.
Utilize 20 μL do produto ssDNA circularizado para sequenciação, seguindo o Manual de Instruções do Conjunto de Sequenciação de Alto Débito.
13. Quantifique 2 μL de DNBs usando o Kit de Análise de ssDNA e o Fluorómetro Qubit. É necessária uma concentração mínima de 8 ng/μL.
14. Carregue cada preparação de DNB numa pista separada para ser processada para sequenciação de 100 bp em pares (PE) seguindo o protocolo do fabricante. Outros instrumentos de sequenciação podem ser utilizados, mas os oligonucleotídeos de sequenciação e as condições terão de ser modificados.