Sequenciação de mRNA vs Sequenciação de RNA Total

A sequenciação de RNA, também conhecida como RNA-Seq, é uma abordagem excepcionalmente potente e abrangente para examinar o transcriptoma das células. O processo de RNA-Seq gira em torno da construção de uma biblioteca de DNA complementar (cDNA) para sequenciação. Para iniciar a construção da biblioteca, o RNA celular é primeiro isolado, seguido por avaliações de controlo de qualidade para determinar a integridade do RNA. Depois, o RNA de interesse na biblioteca pode ser enriquecido através de técnicas de remoção ou triagem, e, subsequentemente, passa por transcrição reversa em cDNA antes da sequenciação.

RNA-Seq encontra amplas aplicações, que vão desde explorações fundamentais da estrutura e função celular até à identificação e análise de várias condições patológicas em amostras clínicas. Esta tecnologia permite a deteção qualitativa e quantitativa de numerosos RNAs em amostras biológicas em pontos temporais específicos. Por exemplo, as alterações na expressão génica antes e depois de uma intervenção terapêutica podem ser comparadas para determinar a presença ou ausência de uma doença. Além disso, o RNA-Seq pode identificar padrões de splicing seletivo, modificações pós-transcricionais e limites de exões e íntrons. Os dados obtidos contêm informações inestimáveis sobre os mecanismos celulares subjacentes, a estrutura do genoma, os efeitos causadores de doenças e muito mais.

Sequenciação de RNA Total

O RNA-Seq total, também conhecido como sequenciação do transcriptoma completo, é um método abrangente que abrange a sequenciação de todas as moléculas de RNA, tanto codificantes como não codificantes. Nesta abordagem, o RNA é sequenciado após a remoção do RNA ribossómico (rRNA), resultando numa coleção diversificada de moléculas de RNA. A isolação inicial do RNA total produz uma mistura de vários RNAs, como rRNAs, RNAs mensageiros precursores (pre-mRNAs), RNAs mensageiros (mRNAs) e diferentes tipos de RNAs não codificantes (ncRNAs), incluindo RNAs de transferência (tRNAs), microARNs (miARNs)e longos fragmentos de RNAs não codificantes (lncRNAs) que não são traduzidos em proteínas (transcritos com mais de 200 nucleotídeos).

Diferentes subtipos de RNA. (Cui et al., 2022)

RNA-Seq Total oferece informações sobre RNAs codificantes e não codificantes (por exemplo, lncRNAs e miRNAs), fornecendo informações valiosas sobre regiões regulatórias, níveis de expressão global dos transcritos, padrões de splicing e a identificação de exões, íntrons e os seus limites.

Durante a sequenciação, muitas leituras de lncRNA podem sobrepor-se a mRNAs. É importante notar que aproximadamente 20% dos genes no genoma humano são transcritos a partir de cadeias opostas, levando a regiões sobrepostas. Consequentemente, métodos de sequenciação total de RNA específicos de cadeia são necessários para distinguir entre essas cadeias. Técnicas de sequenciação específicas de cadeia permitem a identificação da cadeia de DNA específica (cadeia codificadora ou cadeia molde) que gera o transcrito de RNA. Além disso, melhoram a precisão dos dados de expressão génica ao aprimorar a anotação das leituras de sequenciação e facilitar a adição de leituras de sequenciação compatíveis.

Para aumentar a sensibilidade do sequenciamento, o rRNA, que constitui 80-90% do RNA total, é tipicamente removido através da desvio. A eliminação dos transcritos de rRNA permite uma maior concentração de leituras de sequenciamento nos transcritos desejados, aumentando assim a sensibilidade do processo de sequenciamento. A remoção do rRNA é particularmente crucial quando o nível de expressão do transcrito alvo é baixo.

Sequenciação de mRNA

mRNA-Seq é a escolha preferida quando se foca na região codificadora de alvos eucarióticos. Este método utiliza uma técnica de triagem para enriquecer RNAs poli(adenilados) (poly(A)). Uma vez que os mRNAs constituem apenas uma pequena fração do RNA total, sequenciar apenas os mRNAs prova ser a abordagem mais eficiente e económica se estiver alinhada com o objetivo experimental.

Em contraste com a etapa de remoção de rRNA na sequenciação de RNA total, a sequenciação de mRNA baseia-se na triagem por afinidade de Poly(A) para enriquecer o mRNA. Ambos os métodos eliminam efetivamente o rRNA das amostras. A decisão entre remoção de rRNA e enriquecimento de Poly(A) depende de vários fatores, incluindo o tamanho e o tipo da amostra (por exemplo, procariotos, animais e plantas), sendo que cada um requer métodos diferentes.

Métodos de enriquecimento ou remoção de amostras, como a remoção de ribossomas ou o enriquecimento de mRNA, melhoram a qualidade dos dados de sequenciação tanto em fluxos de trabalho de Total RNA-Seq como de mRNA-Seq. Estas abordagens permitem a sequenciação de moléculas de RNA alvo, minimizando o desperdício de leituras de sequenciação.

É crucial identificar a informação desejada a partir dos dados de RNA-Seq, uma vez que isso ajuda a excluir outros tipos de RNAs do processo de sequenciação. Se o foco estiver na região codificadora, o mRNA-Seq é a escolha apropriada. Concentrar-se nos mRNAs fornece dados superiores de expressão génica, uma vez que constituem apenas 3-7% do transcriptoma mamífero. Comparado ao RNA-Seq total, o mRNA-Seq permite a preparação de bibliotecas utilizando tamanhos de amostra menores, ao mesmo tempo que aumenta a profundidade de sequenciação.

Fluxograma de mRNA-seq e pipeline de análise de dados. (Zhao et al. 2016)

As considerações orçamentais também são importantes na seleção do método apropriado. O RNA-Seq total requer mais dados de sequenciamento (tipicamente 100-200 milhões de leituras de sequenciamento por amostra) e acarreta custos mais elevados em comparação com o mRNA-Seq. Se apenas informações de mRNA forem necessárias, o mRNA-Seq oferece maior profundidade de sequenciamento e custos mais baixos do que o RNA-Seq total. Isso ocorre porque as leituras de sequenciamento (tipicamente 25-50 milhões de leituras de sequenciamento por amostra) estão concentradas em moléculas de RNA enriquecidas em Poly(A). Para amostras com material inicial limitado, o mRNA-Seq é o método mais adequado, proporcionando melhores dados de leituras de sequenciamento, custos mais baixos e exigindo menos material inicial.

Como Escolher Sequenciação de mRNA e Sequenciação de RNA Total

A escolha entre as técnicas de RNA-Seq total e mRNA-Seq requer uma consideração cuidadosa do objetivo experimental geral, potenciais questões biológicas e limitações técnicas. Cada método oferece vantagens e desvantagens únicas. O RNA-Seq total proporciona a análise de transcriptoma mais abrangente, capturando todas as espécies de RNA presentes na amostra, incluindo RNAs não codificantes e variantes de splicing alternativo. Por outro lado, o mRNA-Seq foca especificamente em transcritos codificadores de proteínas, fornecendo dados superiores sobre as regiões codificadoras dos genes.

Além do objetivo experimental, vários outros fatores devem ser considerados. O tipo de amostra desempenha um papel crucial na seleção do método apropriado. Para amostras com material inicial limitado, como pequenas amostras de tecido ou células únicas, o mRNA-Seq é frequentemente preferido devido à sua maior sensibilidade e capacidade de trabalhar com quantidades de entrada reduzidas. O Total RNA-Seq, no entanto, é mais versátil e pode lidar com uma gama mais ampla de tipos de amostras, incluindo RNA degradado ou parcialmente fragmentado.

O volume inicial da amostra também deve ser considerado. Se o material inicial disponível for limitado, o mRNA-Seq pode ser uma opção mais viável. Por outro lado, se um volume maior de material inicial estiver disponível, o total RNA-Seq pode ser realizado de forma mais eficiente.

O orçamento do projeto é outro fator importante. mRNA-Seq é geralmente mais rentável, uma vez que se concentra numa porção menor do transcriptoma, enquanto o RNA-Seq total abrange todo o transcriptoma e pode exigir um orçamento maior.

Além disso, é crucial avaliar as limitações e requisitos técnicos de cada método. A mRNA-Seq envolve etapas adicionais para o enriquecimento de mRNA, o que pode introduzir viés. Por outro lado, RNA-Seq total captura toda a população de RNA, mas pode ter menor especificidade para mRNA. Considere a experiência e os recursos disponíveis no laboratório para realizar o método escolhido.

Ao considerar o objetivo experimental, potenciais problemas biológicos, limitações técnicas, tipo de amostra, volume inicial da amostra e orçamento do projeto, pode tomar uma decisão informada sobre se deve utilizar RNA-Seq total ou mRNA-Seq para as suas necessidades de investigação específicas. Também é aconselhável procurar aconselhamento de especialistas ou profissionais de bioinformática para garantir que o método mais apropriado seja escolhido.

Referências:

1. Cui, Lian, et al. "Modificações de RNA: importância na biologia das células imunes e doenças relacionadas." Transdução de sinal e terapia direcionada 7.1 (2022): 334.
2. Zhao, Shanrong, et al. "Bioinformática para análise de dados de RNA-seq." Bioinformática—Características e Aplicações Atualizadas: InTech (2016): 125-49.