Protocolo de Sequenciação Metagenómica

Extração de DNA

Extração de DNA de Solo ou Sedimento

1. Pese 0,5 g de esferas de vidro em um tubo Eppendorf de 2 ml.
2. Neste tubo, pese 0,5 g de solo ou sedimento que foi previamente homogeneizado agitando com uma espátula estéril.
3. Adicione 0,5 ml de tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 8 (use isto para lavar o tubo com a amostra).
4. Adicione 0,5 ml de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico no tubo.
5. Agite com esferas a 8.000 × g por 30 s, coloque no gelo por 30 s e repita por mais 30 s.
6. Centrifugue por 5 min a 16.000 × g (4°C).
7. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo de 2 ml.
8. Adicione volume igual (~500 ml) de clorofórmio-álcool isoamílico e vortex para misturar.
9. Centrifugue por 5 min a 16.000 × g, a 4°C.
10. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2 ml.
11. Adicione 2× o volume de etanol 100% gelado e 1/10 do volume de acetato de sódio e misture. Para extração de RNA, use 2,5× o volume de etanol.
12. Precipite por pelo menos 1 h no congelador.
13. Centrifugue por 30 min a 16.000 × g.
14. Pipete e descarte o líquido, tendo cuidado com o pellet.
15. Lave com 200 ml de etanol a 70%, vortex para misturar.
16. Centrifugue por 10 min a 16.000 × g.
17. Repita os dois últimos passos e remova o etanol restante com uma pipeta. Tenha cuidado com o pellet.
18. Deixe secar ao ar por 10 min. Ressuspenda os pellets em água estéril.

Extração de DNA de Água do Mar

1. Filtre 10-15 L de água do mar através de um filtro GF/A de 140 mm de diâmetro e 1,6 mm, para reduzir a abundância de células eucarióticas e maximizar a proporção de células procarióticas.
2. Aplique o filtrado diretamente em um filtro Sterivex de 0,22 mm.
3. Após a filtração, bombeie a cartucho Sterivex até secar e congele rapidamente em nitrogênio líquido, armazenando a −80°C até a isolação do DNA.
4. Descongele a cartucho Sterivex em gelo.
5. Adicione 1,6 ml de tampão de lise SET diretamente sobre o topo do Sterivex usando uma seringa de 2,5 ml com uma agulha de 25G 5/8".
6. Adicione 180 ml de lisozima fresca e feche o Sterivex.
7. Incube a 37°C por 30 min sob rotação contínua em um forno Hybaid.
8. Adicione 200 ml de SDS (10% p/v) e 55 ml de proteinase K fresca (20 mg/ml).
9. Incube a 55°C por 2 h com rotação contínua em um forno Hybaid.
10. Retire o lisado do Sterivex usando uma seringa de 5 ml.
11. Adicione 1 ml de tampão SET fresco ao Sterivex e gire para enxaguar.
12. Retire o tampão SET na mesma seringa de 5 ml.
13. Adicione o lisado em um tubo Maxtract de 15 ml contendo 2 ml de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1), pH 8.
14. Agite suavemente até misturar. Em seguida, centrifugue a 1.500 × g por 5 min.
15. Adicione mais 2 ml de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1). Agite suavemente até misturar e centrifugue a 1.500 × g por 5 min.
16. Adicione 2 ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Agite suavemente até misturar e centrifugue a 1.500 × g por 5 min.
17. Decante a fase aquosa para um tubo de centrifugação estéril de 20 ml e adicione 0,5 V de acetato de amônio 7,5 M. Misture brevemente e depois adicione 2,5 V de etanol puro.
18. Misture e deixe a −20°C por >1 h (durante a noite é aceitável).
19. Centrifugue a 10.000 × g por 30 min a 4°C e decante o etanol.
20. Adicione 2 ml de etanol a 80% e enxágue o tubo, depois centrifugue a 10.000 × g por 20 min a 4°C e decante o etanol.
21. Repita o passo de lavagem acima.
22. Decante o etanol e deixe invertido por 15 min na capela de exaustão.
23. Suspenda o pellet invisível em 200 ml de água estéril. Deixe em gelo por aproximadamente 1 h com frequentes toques de dedo para enxaguar as paredes do tubo.
24. O DNA pode ser quantificado visualizando-se usando eletroforese em gel de agarose ou usando quaisquer técnicas padrão de quantificação de DNA.
25. Para pirosequenciamento, é necessário ter ~5 mg de DNA, que esta técnica produzirá em excesso. Idealmente, o DNA deve estar a uma concentração de aproximadamente 500 ng/ml.

Sequenciamento

1. O DNA precisa ser medido com precisão. A quantidade ideal é de 3-5 mg para uma biblioteca de fragmentos, mas é possível usar menos com sucesso. Também precisa ter um peso molecular razoável para maximizar o corte aleatório.
2. O DNA em um volume de 100 ml é misturado com 500 ml de tampão de nebulização fornecido com o kit da biblioteca. O DNA é fragmentado colocando-o em um recipiente de nebulização e conectando este a gás nitrogênio a 30 psi por 1 min.
3. O DNA é recuperado da câmara de nebulização e limpo com o kit do fabricante seguindo as instruções fornecidas pelo kit, usando 2,5 ml de tampão PB e eluindo o DNA em 100 ml de tampão de eluição.
4. Neste estágio, os pequenos fragmentos são removidos usando esferas AMPure. Uma quantidade calibrada é adicionada ao DNA para que material com menos de 300 pb permaneça em solução. O DNA de maior peso molecular se liga às esferas, é lavado com etanol a 70%, é seco e é recuperado eluindo em Tris-HCl 10 mM pH 7,5.
5. O DNA é verificado (1 ml de alíquota) quanto à distribuição de tamanho.
6. Outras manipulações são todas descritas no kit da biblioteca. As extremidades do DNA são polidas, os adaptadores (com ou sem códigos de barras) são adicionados, fragmentos contendo adaptadores são selecionados em esferas Dynal, e as extremidades são preenchidas. A biblioteca de fita simples é recuperada derretendo das esferas Dynal com NaOH (0,125 N) conforme as instruções do fabricante e limpa com uma coluna MinElute.
7. A biblioteca é avaliada correndo em um picochip de RNA.
8. Uma quantidade predeterminada da biblioteca é usada para configurar uma reação de PCR em emulsão usando o kit de grande ou pequeno volume. Isso envolve a ligação do DNA a esferas de captura que são específicas para um dos adaptadores.

Referência:

1. Gilbert J A, Laverock B, Temperton B, et al. Metagenomics[M]//High-Throughput Next Generation Sequencing. Humana Press, Totowa, NJ, 2011: 173-183.