Montagem Metagenómica Híbrida para NGS e Sequenciação de Longa Leitura Encontra Chaves para a Investigação de Microbiomas

Enquanto sequenciação metagenómica tornou-se uma ferramenta chave, identificar vias genómicas e funcionais dentro do microbioma continua a ser um desafio na sequenciação de nova geração devido a limitações associadas a leituras curtas (~300 pb). Sequenciação de leitura longa, como a sequenciação por nanopore (ONT), é esperada para contornar estas dificuldades ao fornecer leituras mais longas (>3 mil pares de bases). A sequenciação de longas leituras ajuda a conectar repetições inter-genómicas e a produzir uma melhor montagem de novo de genomas. Montagens metagenómicas híbridas que utilizam dados de leituras curtas e longas têm sido usadas em estudos do microbioma humano e em estudos metagenómicos em vários ambientes complexos. Alguns casos são apresentados abaixo.

OPERA-MS, um montador metagenómico híbrido

O processo OPERA-MS, que primeiro utiliza MEGAHIT, metaSPAdes ou IDBA-UD para a montagem de sequências curtas, depois utiliza sequências longas para construir a estrutura genómica e, em seguida, agrupa os clusters de genes de subespécies bacterianas. E depois avalia a capacidade de montagem.

O OPERA-MS, que combina agrupamento metagenómico com agrupamento consciente de repetições, pode montar com precisão comunidades bacterianas complexas. Os autores descobriram que o OPERA-MS montou pares de bases mais precisos do que o montador de sequências longas (Canu), resultados de montagem mais coerentes do que o montador de sequências curtas (MEGAHIT23, metaSPAdes24, IDBA-UD25) e taxas de erro mais baixas do que o montador híbrido não metagenómico (hybridSPAdes). O processo também pode ser montado na presença de múltiplos isoformas bacterianos. O OPERA-MS pode montar genomas de alta qualidade de espécies escassas (<1%) com uma cobertura de leituras longas de 9×, e genomas quase completos com uma cobertura superior.

Fluxo de trabalho do OPERA-MS (Bertrand D) et al. 2019)

A montagem híbrida de metagenomas permite uma análise de alta precisão de genes de resistência e elementos móveis.

A análise da composição do microbioma foi realizada através de sequenciação metagenómica de alto rendimento. No entanto, os métodos existentes não estão concebidos para montar sequências mistas de comprimento de leitura curto e longo. Os investigadores utilizaram o software de montagem metagenómica híbrido OPERA-MS, que combina a montagem utilizando agrupamento consciente de repetições e métodos de escoramento precisos para alcançar uma montagem precisa de comunidades complexas.

Os investigadores recolheram 197 amostras clínicas de intestinos colonizados com Enterobacteriaceae resistentes a carbapenemas para sequenciação metagenómica de leitura longa e curta. O metagenoma intestinal de 28 pacientes tratados com antibióticos foi montado utilizando o OPERA-MS e mostra que a mistura de dados com comprimentos de leitura longa de nanopore resulta em montagens mais contíguas (uma melhoria de 200 vezes em relação às montagens de leitura curta), incluindo mais de 80 sequências de plasmídeos ou fagos formadores de laços e um novo fago gigante de 263 kbp. O software de montagem híbrida de alta qualidade permite uma visão detalhada da resistência a antibióticos intestinal em pacientes humanos.

Elementos móveis e associação com espécies hospedeiras no microbioma intestinal humano (Bertrand D) et al. 2019)

A montagem metagenómica híbrida liga a estrutura dos carboidratos à função no microbioma intestinal humano.

A diversidade microbiana dentro da microbiota e as suas interações com a saúde e nutrição do hospedeiro são agora amplamente estudadas. Um papel importante da microbiota intestinal humana é a decomposição metabólica de carboidratos complexos provenientes de fontes vegetais e animais (por exemplo, leguminosas, sementes, tecidos e cartilagem). Os ácidos gordos de cadeia curta são o principal produto da fermentação de carboidratos pela microbiota intestinal. No entanto, compreender a complexidade do metabolismo de carboidratos complexos na microbiota intestinal é um grande desafio.

Neste estudo, os investigadores utilizaram montagem metagenómica híbrida para avaliar alterações na composição a nível de espécies na microbiota individual no modelo de controlo intestinal para seis carboidratos estruturalmente distintos. Foram encontrados maiores N50 e os maiores clusters sobrepostos utilizando montagens híbridas em comparação com montagens de leituras curtas. Quinhentos e nove genomas montados a partir de metagenomas (MAGs) de alta qualidade pertencentes a 10 classes bacterianas e 28 famílias bacterianas foram identificados. Espécies bacterianas identificadas como portadoras de genes de módulo de ligação ao amido mostraram um aumento substancial em resposta ao amido. Com a aplicação da metagenómica híbrida, várias espécies não cultivadas com potencial funcional para degradar substratos de amido podem ser identificadas e utilizadas para estudos futuros.

A árvore filogenética foi construída a partir de sequências de proteínas concatenadas usando o PhyloPhlAn e ilustrada usando o ggtree. et al. 2022)

Resumo

A sequenciação metagenómica de leitura longa e curta e a montagem híbrida têm um grande potencial para estudar a microbiota intestinal humana. A montagem híbrida de metagenomas resulta não apenas em alta precisão de bases, mas também em uma melhoria de ordem de magnitude no comprimento de emenda dos dados de sequenciação de leitura curta, permitindo assim a montagem de genomas que estão mais próximos do completo, incluindo genomas de alta qualidade que podem revelar subespécies bacterianas, micróbios raros, plasmídeos e fagos em amostras complexas.

Referências:

1. Bertrand D, Shaw J, Kalathiyappan M, et al. A montagem metagenómica híbrida permite uma análise de alta resolução dos determinantes de resistência e elementos móveis nos microbiomas humanos. Biotecnologia da Natureza, 2019, 37(8): 937-944.
2. Ravi A, Troncoso-Rey P, Ahn-Jarvis J, et al. Assembleias de metagenoma híbrido ligam a estrutura dos carboidratos com a função no microbioma intestinal humano. Biologia das Comunicações, 2022, 5(1): 1-13.