Sequenciação de Longo Alcance HiFi Gera Dados de WGS Abrangentes para Detetar Todos os Tipos de Mutação de Novo

Introdução

A caracterização abrangente de variantes genómicas humanas é importante para obter uma compreensão dos traços genéticos e doenças. Para estudos de doenças raras, é particularmente importante identificar mapas completos de todos os tipos de variantes, incluindo indels, repetições em tandem curtas (STRs) e variantes estruturais (SVs). Um desafio particular para a precisão do sequenciamento do genoma é a mutação de novo (DNM), que demonstrou ser uma causa importante de doenças esporádicas, severas e de início precoce. Cada genoma humano contém em média cerca de 40-90 DNMs, mas estas também estão entre as variantes mais difíceis de identificar. Portanto, a detecção abrangente de todos os tipos de DNMs requer dados de sequenciamento de alta qualidade.

Embora o sequenciamento de leituras curtas possa detectar com precisão variantes pequenas, tem uma sensibilidade limitada para STRs grandes, CNVs e SVs. O sequenciamento de leituras longas tem sido amplamente utilizado para a montagem de novo do genoma humano e para SVs não detectados pelo sequenciamento de leituras curtas, mas a sua baixa precisão a nível de par de bases individuais (bp) impede a detecção fiável de variantes menores que 50 bp. Para atender à necessidade dupla de comprimento de leitura longo e alta precisão na análise do genoma, a PacBio desenvolveu a tecnologia de sequenciamento de leitura longa HiFi que combina tanto o comprimento de leitura longo quanto a alta precisão, tornando o sequenciamento de leitura longa também adequado para detectar variantes pequenas.

Sequenciamento de Leitura Longa HiFi Gera Dados Abrangentes de WGS

Um artigo de pesquisa intitulado "Descoberta abrangente de mutações de novo com sequenciamento de leitura longa HiFi" foi publicado na Genome Medicine. A equipe construiu o conjunto de dados de mutações mais abrangente com apenas uma técnica, o sequenciamento de leitura longa HiFi, permitindo a detecção precisa de substituições, indels, STRs e SVs. A precisão da técnica permite até a detecção sensível de DNMs em todos os diferentes níveis de mutação e também permite o emparelhamento, o que ajuda a distinguir DNMs verdadeiramente positivas de falsas positivas.

Descoberta abrangente de mutações de novo com sequenciamento de leitura longa HiFi. (Kucuk et al., 2023)

A precisão aumentada da base do sequenciamento HiFi é particularmente benéfica para a detecção de pequenas DNMs em comparação com o sequenciamento de leituras curtas e pode até melhorar a sensibilidade. Além disso, ao contrário de outras tecnologias de sequenciamento de leitura longa, a tecnologia HiFi não possui uma química altamente instável, a qualidade dos seus dados é mais estável e o sequenciamento HiFi pode alcançar uma precisão de 99,9%. Portanto, o HiFi pode ser uma ferramenta poderosa para desafios complexos na pesquisa genómica.

Para demonstrar a utilidade do sequenciamento de leitura longa na detecção de mutações de novo, a equipe sequenciou os genomas de oito trios de pais e filhos usando sequenciamento de leitura longa HiFi PacBio com alta profundidade de cobertura (~30x) e sequenciamento de genoma inteiro de leitura curta Illumina (~50x). Para o sequenciamento de leitura longa HiFi, o comprimento médio das leituras obtidas no estudo foi de 17 kb. Mais de 99,0% das 5,7 milhões de leituras por amostra alinharam-se ao genoma de referência, com uma qualidade de mapeamento de 46,5.

Os dados mostraram que, em média, 3,8 milhões de mutações de substituição por amostra foram compartilhadas entre as duas plataformas de sequenciamento, correspondendo a uma concordância de 94,0% entre os ensaios de sequenciamento de leitura longa e leitura curta. De acordo com os resultados, o sequenciamento de leitura longa HiFi ofereceu cerca de 240 Mb de cobertura de sequência para o genoma, ao contrário do sequenciamento de leitura curta. Além disso, a taxa de erro genético mendeliano para o sequenciamento de leitura longa HiFi foi de apenas 2,1%, indicando que a maioria das chamadas de variantes era precisa.

Para indels, o sequenciamento de leitura longa HiFi produziu uma média de 1 milhão de mutações por amostra e o sequenciamento de leitura curta produziu uma média de 900.000 indels. A concordância foi de 63,1% para o sequenciamento de leitura curta e 58,0% para o sequenciamento de leitura longa HiFi, com aproximadamente 25% dos indels sendo detectados em regiões não cobertas pelo sequenciamento de leitura curta. Além disso, a razão MIE de indels únicos para o sequenciamento de leitura longa HiFi (8,9%) foi inferior à de indels únicos para o sequenciamento de leitura curta (13,0%), indicando que o sequenciamento de leitura longa HiFi é melhor na detecção de indels.

No geral, a precisão do sequenciamento de leitura longa HiFi permite a identificação sensível de DNMs a nível de todas as variantes e também permite a fixação, o que ajuda a distinguir DNMs verdadeiramente positivas de falsas positivas.

mutação de novo (DNM). (Kucuk et al., 2023)

Um conjunto de dados abrangente de WGS pode ser gerado por uma única tecnologia, o sequenciamento de leitura longa HiFi, permitindo a identificação precisa de substituições, indels, STRs e SVs. Isso significa que pacientes com doenças raras de origem genética suspeita podem ser testados verdadeiramente de forma abrangente com apenas um teste abrangente. A precisão desta tecnologia é significativa para o diagnóstico de doenças severas de início precoce.

Referência:

1. Kucuk, Erdi, et al. "Descoberta abrangente de mutações de novo com sequenciamento de leitura longa HiFi." Genome Medicine 15.1 (2023): 1-15.