Introdução aos Variantes de Sequência de Amplicon

Nos últimos anos, sequenciação de amplicões a tecnologia emergiu como uma ferramenta crítica para o estudo de microbiomas, oncologia e genética. Ao realizar sequenciação de alto rendimento de regiões genéticas específicas, os investigadores podem desvendar a estrutura, funções e mudanças dinâmicas das comunidades microbianas a partir de amostras complexas. Na análise de dados de sequenciação de amplicons, a tabela de variantes de sequência de amplicon (ASV) é uma das saídas de dados principais, fornecendo uma visão detalhada das variações de sequência e servindo como uma base fundamental para os subsequentes. análises de bioinformática.

Atualmente, os principais pipelines analíticos, como o QIIME 2 e o DADA2, destacam-se na geração de tabelas de ASV. No entanto, ainda há espaço para melhorias em áreas como processamento de dados, anotação funcional e integração entre plataformas. Este artigo explora a construção e as aplicações de amplicões, destacando os mais recentes avanços e direções futuras neste campo.

O que são Variantes de Sequência de Amplicon?

Os Variantes de Sequência de Amplicon (ASVs) tornaram-se uma técnica de alta resolução amplamente adotada na pesquisa do microbioma. Em contraste com os métodos convencionais baseados em Unidades Taxonómicas Operacionais (OTUs), os ASVs detetam variações de sequência a nível de um único nucleótido, permitindo uma precisão e fiabilidade aprimoradas. Ao analisar dados de amplicons de 16S rRNA, 18S rRNA ou ITS, as tabelas de características ASV oferecem informações detalhadas sobre a composição microbiana e a abundância das amostras. Isso torna-os uma ferramenta poderosa para examinar a diversidade, prever funções e avançar nos estudos ecológicos.

Variantes de Sequência de Amplicon vs OTUs

ASVs e OTUs são ambos métodos utilizados para analisar comunidades microbianas com base em dados de sequenciação, mas diferem na sua abordagem. Os OTUs agrupam sequências com base em um limiar de similaridade pré-definido, tipicamente 97% de identidade, o que pode levar à perda de resolução. Em contraste, os ASVs identificam variações de sequência a nível de um único nucleótido. A seleção de ASV ou OTU A análise de dados de sequenciação de amplicões depende dos objetivos de pesquisa, do desenho experimental e das características da amostra.

Construção da Tabela de Variantes de Sequência de Amplicon

1. Aquisição de Dados

A construção de uma tabela de características ASV começa com dados de sequenciação de amplicões de alta qualidade. As plataformas comumente utilizadas incluem Illumina MiSeq e HiSeq, cujas capacidades de sequenciação de extremidades emparelhadas podem cobrir totalmente regiões hipervariáveis, como as regiões V3-V4 ou V4-V5 do gene 16S rRNA. Escolher a plataforma de sequenciação apropriada e a região-alvo é crucial para garantir a precisão da análise posterior.

2. Pré-processamento de Dados

A pré-processamento de dados é fundamental para a construção da tabela de características de ASV e envolve os seguintes passos:

• Remoção de Sequências de Baixa QualidadeUtilize ferramentas de controlo de qualidade (por exemplo, FastQC) para avaliar a qualidade das sequências brutas. Identificar e eliminar sequências genéticas comprometidas é crucial, particularmente aquelas caracterizadas por uma abundância de nucleotídeos ambíguos, métricas de qualidade de base subótimas ou comprimentos de fragmentos insuficientes. O corte e a filtragem podem ser realizados através de ferramentas computacionais robustas como Trimmomatic e Cutadapt.
• Remoção de Sequências de Adaptadores e PrimersConjuntos de dados de amplicon frequentemente contêm contaminação de primers ou adaptadores, o que pode introduzir complicações analíticas significativas. Abordagens computacionais, incluindo o Cutadapt e bibliotecas de processamento de dados especializadas, permitem a remoção eficaz desses elementos genéticos extraneous.
• Remoção de DNA do HospedeiroAmostras genómicas frequentemente contêm DNA derivado do hospedeiro de organismos como humanos, animais ou plantas, o que pode comprometer a especificidade da investigação. Protocolos de descontaminação abrangentes envolvem técnicas de alinhamento que identificam e excluem sistematicamente sequências que correspondem ao genoma do hospedeiro, garantindo uma análise genética precisa e direcionada.

3. Desruído de Sequência

A remoção de ruído é o passo central da abordagem ASV. Ao contrário da agrupamento de OTUs, os algoritmos de remoção de ruído distinguem variantes de sequência com resolução de nucleótido único. Ferramentas comuns incluem:

• DADA2: Utiliza um modelo probabilístico para corrigir erros de sequenciação e gerar ASVs sem erros. Antes de realizar o processamento DADA2, assegure-se de que os dados de sequenciação cumpram as seguintes três condições: Primeiro, as amostras devem ser divididas em ficheiros .fastq separados; segundo, sequências não biológicas, como primers e adaptadores, devem ser removidas. Caso contrário, podem ser utilizados comandos de corte para remover essas sequências de ambas as extremidades das leituras; e terceiro, para sequenciação de extremidade emparelhada, os ficheiros .fastq de avanço e retrocesso devem conter sequências correspondentes.
• Deblur: Aplica um modelo de distribuição fixa para um processamento eficiente de sequências de leituras curtas.

4. Geração da Tabela de Funcionalidades ASV

As sequências desruídas são utilizadas para construir uma tabela de características de ASV, tipicamente representada como uma matriz onde as linhas correspondem a ASVs, as colunas representam amostras e os valores das células indicam a abundância de ASV em cada amostra. A normalização e a filtragem de ASVs de baixa abundância podem ser aplicadas para reduzir o ruído.

Tabela 1. A tabela ASV gerada

Aplicações das Tabelas de Características ASV

1. Análise da Diversidade da Comunidade Microbiana

As tabelas de características ASV permitem análises robustas de diversidade α e β:

• α DiversidadeFoca na medição da riqueza e uniformidade de espécies dentro de amostras individuais. Os índices comuns utilizados para quantificar a diversidade α incluem o Chao1, que estima a riqueza total de espécies, e o índice de Shannon, que considera tanto a abundância quanto a uniformidade das espécies.
• β DiversidadeAvalia as diferenças na composição da comunidade entre amostras, frequentemente visualizadas através de técnicas como Análise de Coordenadas Principais (PCoA) ou Escalonamento Multidimensional Não Métrico (NMDS).

Predição Funcional

Ao integrar tabelas de ASV com ferramentas de previsão funcional, como o PICRUSt2, os investigadores podem estimar as capacidades funcionais das comunidades microbianas. Por exemplo, um estudo que explorou a microbiota intestinal utilizou o PICRUSt2 para prever vias metabólicas ligadas a táxons microbianos identificados nas tabelas de ASV. Esta análise destacou associações entre ASVs específicos e um aumento no metabolismo de carboidratos, oferecendo potenciais insights sobre estratégias dietéticas que poderiam melhorar a saúde intestinal (Wu, Y., et al., 2021).

Fig. 1. Alterações na composição microbiana intestinal em diferentes estados de doença. (Wu, Y., et al., 2021).

3. Descoberta de Biomarcadores para Doenças

A alta resolução dos ASVs facilita a identificação de biomarcadores microbianos associados a doenças. Um exemplo notável é a descoberta de ASVs específicos em pacientes com câncer colorretal que estavam significativamente enriquecidos em comparação com os controles saudáveis. Neste caso, os ASVs atribuídos a C. scindens e Blautia sp. foram identificados como potenciais biomarcadores para a deteção precoce do câncer colorretal, demonstrando como as tabelas de características de ASV podem ser instrumentais em diagnósticos clínicos (Wu, Y., et al., 2021).

Fig. 2. Desempenho na discriminação de adenomas de controles ou câncer utilizando características importantes. (Wu, Y., et al., 2021).

4.Estudios de Ecologia Ambiental

As tabelas de ASV são amplamente aplicadas no estudo de comunidades microbianas em solo, água e ar. Uma análise abrangente de ecossistemas de água doce revelou que as avaliações baseadas em ASV podiam detectar alterações na diversidade microbiana devido aos níveis de poluição. Os investigadores descobriram que ASVs específicas eram indicadores da qualidade da água, fornecendo informações valiosas para o monitoramento ambiental e esforços de conservação (Townsend, A., et al., 2023).

Vantagens da Abordagem ASV

• Alta Resolução: A abordagem ASV fornece dados de alta resolução ao distinguir variantes de sequência a nível de nucleótido único. Esta capacidade é crucial para identificar com precisão espécies microbianas.
• Reproduzibilidade: Os métodos ASV melhoram a reproduzibilidade em estudos microbianos ao produzir resultados que são consistentes e independentes de limiares de agrupamento subjetivos.
• Integração de Bases de Dados: A capacidade de alinhar diretamente ASVs com bases de dados de referência como SILVA e Greengenes melhora a precisão da classificação.

Ferramentas e Recursos

1. Variantes de sequência de amplicon dada2

DADA2 (Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2) é um pacote de software de código aberto projetado para modelar e corrigir erros de sequenciação de várias plataformas de sequenciação (Illumina, Roche 454) em dados de amplicão. Nos fluxos de trabalho de análise de amplicão, o algoritmo DADA2 infere com precisão as sequências das amostras e identifica variações de nucleotídeos únicos, frequentemente detectando mais variantes verdadeiras e gerando menos sequências erróneas do que outros métodos. O DADA2 opera construindo um modelo de taxa de erro para inferir se uma sequência de amplicão se origina do template, utilizando um modelo de erro baseado nos próprios dados, sem depender de modelos de distribuição externos. A principal vantagem do DADA2 reside no seu uso de mais dados, uma vez que o modelo de erro incorpora informações de qualidade, enquanto outros métodos ignoram essa informação após a filtragem de sequências de baixa qualidade. Além disso, o modelo de erro do DADA2 leva em conta a abundância quantitativa e calcula as probabilidades de várias variantes de sequência.

Outras ferramentas

QIIME2 (Insights Quantitativos na Ecologia Microbiana 2) é um conjunto de software de código aberto projetado para a análise de microbiomas. Oferece uma variedade de ferramentas e fluxos de trabalho para processar e analisar dados de microbiomas.

PICRUSt2: Uma ferramenta para previsões funcionais com base em tabelas ASV.

2. Bases de Dados de Referência

SILVA: Suporta a anotação taxonómica de sequências de rRNA 16S/18S.

Greengenes: Fornece informações de classificação para bactérias e arqueias.

UNITE: Especializa-se na anotação de sequências ITS de fungos.

3. Recursos de Dados Abertos

Os investigadores podem aceder a dados de amplicão de 16S rRNA a partir de plataformas como NCBI, EMBL-EBI ou MG-RAST para aprender ou testar fluxos de trabalho de ASV.

Direcções Futuras

• Integração com Sequenciação de Longas Leituras: Combinar métodos ASV com sequenciação PacBio ou Nanopore irá aumentar a precisão das sequências e facilitar análises de genoma completo.
• Integração Multi-ômica: Fusão de dados de ASV com transcriptómica, metabolómica e outros conjuntos de dados para descobrir redes ecológicas e funcionais complexas.
• Desenvolvimento de Algoritmos Eficientes: Criação de algoritmos mais rápidos para apoiar a construção e análise em larga escala de tabelas de características ASV.

Conclusão

Como um método analítico de alta resolução, as tabelas de características ASV demonstraram um potencial notável na pesquisa do microbioma. Seja para descobrir a diversidade da comunidade, prever capacidades funcionais ou identificar biomarcadores de doenças, as abordagens ASV oferecem perspetivas e suporte de dados únicos. Com os avanços na tecnologia de sequenciação e nas ferramentas computacionais, as aplicações e a profundidade da pesquisa das tabelas de características ASV continuarão a expandir-se, impulsionando a inovação na ecologia microbiana e na investigação médica.

Referências:

1. Wu, Y., Jiao, N., Zhu, R. et al. Identificação de marcadores microbianos em diferentes populações na deteção precoce do câncer colorretal. Nat Commun 12, 3063 (2021). Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o aqui e terei o prazer de ajudar com a tradução.
2. Townsend, A., den Bakker, H. C. et al. (2023). Análise do microbioma 16S de comunidades microbianas em centros de distribuição que manuseiam produtos frescos. Frontiers in microbiology, 14, 1041936. Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. No entanto, posso ajudar com traduções de texto que você fornecer.