Um Guia para Iniciantes sobre Sequenciação de Amplicões 16S/18S/ITS

O que é o sequenciamento de amplicões 16S/18S/ITS?

Sequenciação de amplicons é uma abordagem direcionada que se concentra em regiões específicas do DNA ou RNA dentro de uma amostra. Envolve a amplificação e sequenciação de um gene ou região genómica específica de interesse. A região mais frequentemente alvo na ecologia microbiana é o gene 16S rRNA para bactérias e arqueias. Este gene contém regiões conservadas que permitem o design de primers universais, que podem amplificar e sequenciar uma ampla gama de táxons microbianos. Ao sequenciar o gene 16S rRNA, os investigadores podem determinar a composição taxonómica da comunidade microbiana presente na amostra. A sequenciação de amplicões fornece informações sobre a diversidade e abundância relativa de diferentes táxons, mas é limitada na sua capacidade de fornecer informações funcionais.

Se quiser saber mais sobre isso, consulte o nosso artigo. Princípios e Fluxo de Trabalho do Sequenciamento de Amplicões 16S/18S/ITS.

Qual é a diferença entre metagenómica e sequenciação de amplicões?

Sequenciação metagenómica, por outro lado, envolve a sequenciação de todo o material genético (DNA ou RNA) presente numa amostra, sem direcionar para regiões específicas. Fornece uma visão abrangente de toda a comunidade microbiana, incluindo tanto os microrganismos conhecidos como os desconhecidos. A sequenciação metagenómica pode identificar não apenas a composição taxonómica da comunidade, mas também o potencial funcional dos microrganismos presentes. Ao analisar todo o material genético, os investigadores podem estudar todo o genoma microbiano e identificar a presença de genes e vias específicas envolvidas em várias funções, como metabolismo, resistência a antibióticos e virulência. A sequenciação metagenómica proporciona uma resolução mais alta em termos de identificação taxonómica e potencial funcional em comparação com a sequenciação de amplicões, mas pode ser mais exigente em termos computacionais e financeiros.

Referir-se a Introdução à Metagenómica Shotgun, da Amostragem à Análise de Dados para mais informações.

Em resumo, a sequenciação de amplicons fornece informações sobre a composição taxonómica e a abundância relativa de táxons microbianos específicos dentro de uma comunidade, enquanto a sequenciação metagenómica oferece uma visão mais abrangente de toda a comunidade microbiana, incluindo informações taxonómicas, bem como potencial funcional. A escolha entre sequenciação de amplicons e sequenciação metagenómica depende dos objetivos da pesquisa, dos recursos disponíveis e do nível de detalhe necessário para a análise.

Sequenciação Sanger vs. sequenciação direcionada baseada em NGS vs. sequenciação de leitura longa

A sequenciação de amplicões, abrangendo tanto a sequenciação Sanger como as abordagens de sequenciação de nova geração (NGS), emergiu como uma ferramenta poderosa para investigar comunidades microbianas e análises genéticas direcionadas. Compreender os pontos fortes e as limitações de cada técnica é crucial para desenhar estratégias experimentais eficazes e interpretar os resultados com precisão.

Ao empregar princípios de terminação de cadeia, Sequenciação de Sanger fornece dados de sequenciação fiáveis e altamente precisos, tornando-se uma escolha ideal para confirmar e validar resultados obtidos a partir de projetos de sequenciação de amplicões em maior escala. No entanto, devido ao seu baixo rendimento e à sua natureza demorada, a sequenciação Sanger é menos adequada para estudos de alto rendimento que envolvem um grande número de fragmentos de ADN.

Aproveitando o poder de sequenciação de próxima geração plataformas, como o sequenciamento Illumina, e empregando estratégias como sequenciamento de amplicões ou captura híbrida para enriquecer seletivamente as regiões de interesse. A capacidade de multiplexar amostras, onde várias amostras são agrupadas e sequenciadas juntas, aumenta significativamente o rendimento e reduz os custos por amostra, facilitando a análise abrangente de variações genéticas complexas e de diversas comunidades microbianas.

Além disso, é essencial considerar o surgimento de sequenciação de leitura longa tecnologias, como Sequenciação PacBio e Sequenciação Oxford Nanopore, no contexto da sequenciação de amplicões. A sequenciação de leitura longa oferece vantagens incomparáveis, especialmente leituras de sequenciação significativamente mais longas em aplicações como montagem de genoma de novo, faseamento de haplótipos e caracterização de rearranjos genómicos intrincados. No entanto, vale a pena notar que as tecnologias de sequenciação de leitura longa geralmente apresentam taxas de erro mais elevadas e têm limitações em termos de rendimento e custo por base.

Cada método possui as suas próprias forças e considerações distintas, exigindo uma cuidadosa análise dos objetivos de pesquisa, tamanho da amostra, cobertura desejada e recursos disponíveis.

rRNA 16S bacteriano

Existem três tipos de RNA ribossómico bacteriano (rRNA): rRNA 5S (120 bp), rRNA 16S (cerca de 1540 bp) e rRNA 23S (cerca de 2900 bp). O rRNA 16S é frequentemente encontrado em células procarióticas e tem um alto conteúdo e número de cópias (representando mais de 80% do RNA total bacteriano), fácil acesso a modelos, alta homologia funcional e informação genética moderada. Os rRNAs 16S são comumente encontrados em células procarióticas e têm um alto conteúdo e número de cópias (80% do RNA total bacteriano).

Existem nove regiões conservadas e nove regiões altamente variáveis na sequência do gene codificador do rRNA 16S. Entre elas, a região V3-V4 tem boa especificidade e informações de base de dados completas, sendo a melhor escolha para a anotação da análise da diversidade bacteriana.

O esquema do complexo ribossómico e do gene 16S rRNA. (Fukuda et al., 2016)

rRNA 18S eucariótico

O gene 18S rRNA é uma sequência de ADN que codifica uma subunidade pequena dos ribossomas eucarióticos, que possui regiões conservadas e variáveis (V1-V9, sem a região V6). Dentre elas, a região V4 é a mais utilizada, possui as informações de base de dados mais completas e a melhor classificação, sendo a melhor escolha para a anotação da análise do gene 18S rRNA.

gene 18S rRNA.

rRNA 16S arqueal

Arqueobactérias, também conhecidas como arqueobactérias e arqueias, são uma classe muito especial de bactérias que possuem algumas características tanto de procariotos como de eucariotos. Para a plataforma de sequenciamento Illumina 2×250 bp, o primer 519F/915R é o mais adequado.

Sequências ITS fúngicas

As sequências ITS são Espaçadores Transcritos Internamente (ITS 1 e ITS 2), que estão localizados entre os genes de rRNA fúngico 18S, 5.8S e 28S, respetivamente. Os fragmentos de sequência ITS são pequenos (350 bp e 400 bp para ITS 1 e ITS 2, respetivamente), fáceis de analisar e têm sido amplamente utilizados para análise filogenética de diferentes espécies fúngicas.

Estudos de sequenciação de alto rendimento (HTS) de comunidades fúngicas. (Nilsson et al., 2019)

Análise da diversidade de microrganismos funcionais específicos

Microrganismos funcionais são uma classe de microrganismos que têm recebido ampla atenção na natureza devido à sua importância funcional, como as bactérias nitrificantes, bactérias desnitrificantes, bactérias oxidantes de amónia, bactérias redutoras de sulfato, bactérias fixadoras de azoto, entre outras.

Cada microrganismo funcional pode ser muito diferente taxonomicamente, mas possui genes semelhantes que lhes permitem desempenhar a mesma função, por isso os genes que permitem a esses bactérias funcionais realizar esta função específica são chamados de genes funcionais, como nxrA, nirS/nirK, amoA, dsrB, nifH, nifH.

Fluxo de análise de dados de sequenciação de amplicões

Os dados a montante são filtrados para remover leituras de baixa qualidade, e os dados limpos de alta qualidade restantes podem ser utilizados para a análise posterior; as leituras são unidas em Tags pela relação de sobreposição entre as leituras; as Tags são agrupadas em OTUs com uma similaridade dada, e depois os OTUs são comparados com a base de dados para anotar os OTUs com espécies; com base nos OTUs e nos resultados da anotação de espécies, foram utilizados para analisar a complexidade das espécies da amostra e as diferenças entre grupos.

Pipeline de análise de sequenciação de amplicões da CD Genomics

Por favor, leia o nosso artigo. Análise Bioinformática de Sequenciamento de Amplicões de 16S rRNA para mais detalhes.

Aplicação da tecnologia de sequenciação de amplicões

A sequenciação de amplicons encontra amplas aplicações em vários campos, permitindo que os investigadores explorem e compreendam comunidades microbianas em diversos ambientes. Algumas áreas de aplicação notáveis incluem:

(i) Campo MédicoA sequenciação de amplicões permite investigar a relação entre microrganismos e doenças humanas. Ajuda a explorar o papel das comunidades microbianas em condições como doenças metabólicas, doenças digestivas, doenças autoimunes, câncer tumoral, doenças neurológicas e outras enfermidades. Ao perfilar a microbiota, os investigadores podem identificar potenciais biomarcadores, alvos terapêuticos e intervenções para melhorar a saúde humana.

(ii) ZootecniaA sequenciação de amplicons desempenha um papel crucial no estudo das interacções entre comunidades microbianas no intestino, rúmen e outros ambientes associados a animais. Ajuda os investigadores a explorar o impacto da microbiota na reprodução, crescimento e desenvolvimento animal, saúde nutricional, função imunológica e tratamento de doenças. Ao compreender a ecologia microbiana nos sistemas animais, os cientistas podem optimizar a saúde e a produtividade animal.

(iii) AgriculturaA sequenciação de amplicons facilita a investigação das interacções microbianas dentro da rizosfera e de outros ambientes associados às plantas. Os investigadores podem estudar os efeitos de práticas agrícolas como a lavra, a fertilização e a rotação de culturas nas comunidades microbianas do solo. Compreender a interacção entre microrganismos e plantas ajuda a melhorar a produtividade agrícola, o ciclo de nutrientes, a saúde das plantas e as práticas agrícolas sustentáveis.

(iv) Estudos AmbientaisA sequenciação de amplicões permite a caracterização de comunidades microbianas em vários ambientes, incluindo locais poluídos como neblina, poeira, áreas residenciais, centros comerciais e habitats naturais como corpos de água e ecossistemas marinhos. Ajuda a compreender a distribuição, composição e dinâmica das populações microbianas em diferentes ecossistemas. Além disso, a sequenciação de amplicões contribui para a investigação sobre a fermentação e tratamento de fertilizantes orgânicos, tratamento de esgoto, degradação de petróleo e outros processos ambientais.

(v) BioenergiaA sequenciação de amplicões desempenha um papel vital na investigação em bioenergia ao permitir a identificação e caracterização de estirpes funcionais especiais e genes relevantes para a produção de biocombustíveis. Ajuda na mineração de genes e no desenvolvimento de bactérias engenheiradas com capacidades melhoradas para a produção de bioenergia.

(vi) Ambientes Extremamente EspeciaisA sequenciação de amplicons é fundamental para o estudo de táxons microbianos que prosperam em condições ambientais extremas, como temperaturas extremas, alta salinidade, pH ácido ou alcalino e outros ambientes desafiadores. Ao analisar a diversidade microbiana e o potencial funcional nestes ambientes extremos, os investigadores obtêm informações sobre as estratégias de adaptação dos microrganismos e o seu papel na dinâmica dos ecossistemas.

Tipos de amostras para sequenciação de amplicões

As técnicas de sequenciação de amplicons, incluindo a sequenciação de amplicons 16S, 18S e ITS, são aplicáveis a uma ampla gama de tipos de amostras.

Por favor, reveja o nosso Diretrizes para Submissão de Amostras para os métodos de recolha e manuseamento de amostras de sequenciação de amplicões mais abrangentes.

Referências:

1. Fukuda, Kazumasa, et al. "Abordagens moleculares para estudar comunidades microbianas: direcionando o gene do RNA ribossómico 16S." Revista da UOEH 38.3 (2016): 223-232.
2. Nilsson, R. Henrik, et al. "Diversidade do micobioma: sequenciação de alto rendimento e identificação de fungos." Nature Reviews Microbiology 17.2 (2019): 95-109.